304 komponèn kimia tabung coil stainless steel, Struktur ectodomain SPACA6 ngemot superfamili protein sing dikonservasi sing ana hubungane karo fusi gamet.

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Slider nuduhake telung artikel saben slide.Gunakake tombol mburi lan sabanjuré kanggo mindhah liwat minger, utawa tombol controller geser ing mburi kanggo mindhah liwat saben geser.

SPACA6 minangka protein permukaan sing diekspresikan sperma sing penting kanggo fusi gamet sajrone reproduksi seksual mamalia.Senadyan peran dhasar iki, fungsi spesifik SPACA6 kurang dimangerteni.Kita njlentrehake struktur kristal domain ekstraselular SPACA6 kanthi resolusi 2.2 Å, ngungkapake protein rong domain sing kasusun saka bundle papat untai lan β-sandwich kaya Ig sing digabung karo penghubung kuasi-fleksibel.Struktur iki mirip karo IZUMO1, protein liyane sing digandhengake karo fusi gamet, nggawe SPACA6 lan IZUMO1 minangka anggota pendiri superfamili protein sing ana hubungane karo pembuahan sing diarani ing kene minangka superfamili IST.Superfamili IST sacara struktural ditetepake kanthi bundle papat heliks sing bengkong lan sepasang motif CXXC sing disambungake disulfida.Panelusuran AlphaFold adhedhasar struktur saka proteome manungsa ngenali anggota protein tambahan saka superfamili iki;notabene, akeh protein iki melu fusi gamet.Struktur SPACA6 lan hubungane karo anggota superfamili IST liyane nyedhiyakake link sing ilang ing kawruh kita babagan fusi gamet mamalia.
Saben urip manungsa diwiwiti kanthi rong gamet haploid sing kapisah: sperma bapak lan endhog ibu.Sperma iki minangka pemenang saka proses seleksi sing kuat sajrone jutaan sel sperma ngliwati saluran genital wanita, ngatasi macem-macem alangan1 lan ngalami kapasitansi, sing ningkatake motilitas lan proses komponen permukaan2,3,4.Sanajan sperma lan oosit ketemu, proses kasebut durung rampung.Oosit diubengi dening lapisan sel kumulus lan penghalang glikoprotein sing disebut zona pellucida, sing kudu dilewati sperma kanggo mlebu oosit.Spermatozoa nggunakake kombinasi molekul adhesi permukaan lan enzim sing digandhengake karo membran lan disekresi kanggo ngatasi alangan pungkasan5.Molekul lan enzim kasebut utamane disimpen ing membran njero lan matriks akrosomal lan dideteksi nalika membran njaba sperma dilisis nalika reaksi akrosomal6.Langkah pungkasan ing lelampahan sing kuat iki yaiku acara fusi sperma-endhog, ing ngendi rong sel kasebut nggabungake membran dadi siji organisme diploid7.Sanajan proses iki minangka terobosan ing reproduksi manungsa, interaksi molekuler sing dibutuhake kurang dimangerteni.
Saliyane pembuahan gamet, kimia fusi rong lapisan lipid wis diteliti sacara ekstensif.Umumé, fusi membran minangka proses sing ora nyenengake kanthi energik sing mbutuhake katalis protein kanggo ngalami owah-owahan konformasi struktur sing ndadekake rong membran luwih cedhak, ngrusak kontinuitas lan nyebabake fusi8,9.Katalis protein iki dikenal minangka fusogens lan wis ditemokake ing sistem fusi sing ora kaetung.Iki dibutuhake kanggo mlebu virus menyang sel inang (contone, gp160 ing HIV-1, spike ing coronaviruses, hemagglutinin ing virus influenza)10,11,12 plasenta (syncytin)13,14,15 lan fusi pembentuk gamet ing eukariota ngisor ( HAP2/GCS1 ing tetanduran, protista lan arthropoda) 16,17,18,19.Fusogens kanggo gamet manungsa durung ditemokaké, sanajan sawetara protèin wis ditampilake kritis kanggo lampiran gamet lan fusi.CD9 sing diekspresikan oosit, protein transmembran sing dibutuhake kanggo fusi gamet tikus lan manungsa, sing pisanan ditemokake 21,22,23.Sanajan fungsi sing tepat tetep ora jelas, peran ing adhesi, struktur fokus adhesi ing mikrovili endhog, lan / utawa lokalisasi protein permukaan oosit sing bener katon 24,25,26.Rong protèin paling khas sing penting kanggo fusi gamet yaiku protein sperma IZUMO127 lan protein oosit JUNO28, lan asosiasi bebarengan minangka langkah penting ing pangenalan lan adhesi gamet sadurunge fusi.Tikus knockout Izumo1 lanang lan tikus knockout Juno wadon pancen steril, ing model iki sperma mlebu ing ruang perivitelline nanging gamet ora gabung.Kajaba iku, confluence dikurangi nalika gamet diobati karo antibodi anti-IZUMO1 utawa JUNO27,29 ing eksperimen pembuahan in vitro manungsa.
Bubar, klompok sing mentas ditemokaké saka sperma-diekspresikan protein phenotypically padha IZUMO1 lan JUNO20,30,31,32,33,34,35 wis ditemokaké.Sperma acrosomal membrane-related protein 6 (SPACA6) wis diidentifikasi minangka penting kanggo pembuahan ing studi mutagenesis murine skala gedhe.Penyisipan transgen menyang gen Spaca6 ngasilake spermatozoa nonfusible, sanajan spermatozoa kasebut nyusup menyang ruang perivitelline 36.Pasinaon kalah sakteruse ing tikus dikonfirmasi manawa Spaca6 dibutuhake kanggo fusi gamet 30,32.SPACA6 diungkapake meh sacara eksklusif ing testis lan nduweni pola lokalisasi sing padha karo IZUMO1, yaiku ing jero intima spermatozoa sadurunge reaksi akrosomal, lan banjur pindhah menyang wilayah khatulistiwa sawise reaksi akrosomal 30,32.Spaca6 homologues ana ing macem-macem mamalia lan eukariota liyane 30 lan wigati kanggo fusi gamet manungsa wis dituduhake dening inhibisi pembuahan manungsa ing vitro dening resistance kanggo SPACA6 30.Ora kaya IZUMO1 lan JUNO, rincian struktur, interaksi, lan fungsi SPACA6 tetep ora jelas.
Kanggo luwih ngerti proses dhasar sing ndasari fusi sperma lan endhog manungsa, sing bakal ngidini kita ngandhani perkembangan masa depan babagan perencanaan kulawarga lan perawatan kesuburan, kita nganakake studi struktural lan biokimia SPACA6.Struktur kristal domain ekstraselular SPACA6 nuduhake bundel papat heliks (4HB) lan domain kaya immunoglobulin (kaya Ig) sing disambungake dening wilayah kuasi-fleksibel.Kaya sing diprediksi ing studi sadurunge, 7,32,37 struktur domain SPACA6 padha karo IZUMO1 manungsa, lan loro protein kasebut nuduhake motif sing ora biasa: 4HB kanthi permukaan heliks segitiga lan sepasang motif CXXC sing disambungake disulfida.Kita ngusulake yen IZUMO1 lan SPACA6 saiki nemtokake superfamili protein sing luwih gedhe lan struktural sing ana gandhengane karo fusi gamet.Nggunakake fitur unik kanggo superfamili, kita nindakake telusuran lengkap kanggo proteome manungsa struktural AlphaFold, ngenali anggota tambahan saka superfamili iki, kalebu sawetara anggota sing melu fusi gamet lan / utawa pembuahan.Saiki katon ana lipatan struktural umum lan superfamili protein sing ana gandhengane karo fusi gamet, lan struktur kita nyedhiyakake peta molekul babagan aspek penting mekanisme fusi gamet manungsa.
SPACA6 minangka protein transmembran siji-pass kanthi siji glycan sing disambung N lan enem ikatan disulfida putative (Gambar S1a lan S2).Kita nyatakake domain ekstraselular SPACA6 manungsa (residu 27-246) ing sel Drosophila S2 lan ngresiki protein nggunakake afinitas nikel, pertukaran kation, lan kromatografi pengecualian ukuran (Gbr. S1b).Ectodomain SPACA6 sing diresiki stabil banget lan homogen.Analisis nggunakake kromatografi eksklusi ukuran sing digabungake karo panyebaran cahya poligonal (SEC-MALS) nuduhake siji puncak kanthi bobot molekul sing diitung 26,2 ± 0,5 kDa (Gbr. S1c).Iki konsisten karo ukuran ectodomain monomerik SPACA6, nuduhake yen oligomerisasi ora kedadeyan sajrone pemurnian.Kajaba iku, spektroskopi circular dichroism (CD) ngungkapake struktur α/β campuran kanthi titik lebur 51,3 °C (Gbr. S1d,e).Dekonvolusi saka spektrum CD nuduhake 38,6% α-heliks lan 15,8% unsur β-stranded (Gambar S1d).
Ectodomain SPACA6 dikristalisasi kanthi nggunakake seeding matriks acak38 ngasilake set data kanthi resolusi 2.2 Å (Tabel 1 lan Gambar S3).Nggunakake kombinasi substitusi molekuler adhedhasar fragmen lan data phasing SAD kanthi paparan bromida kanggo nemtokake struktur (Tabel 1 lan Gambar S4), model olahan pungkasan kasusun saka residu 27-246.Nalika struktur ditemtokake, ora ana struktur eksperimen utawa AlphaFold sing kasedhiya.SPACA6 ectodomain ukuran 20 Å × 20 Å × 85 Å, kasusun saka pitung heliks lan sangang β-untaian, lan nduweni lipatan tersier elongated stabil dening enem ikatan disulfida (Fig. 1a, b).Kapadhetan elektron sing ringkih ing mburi rantai sisih Asn243 nuduhake yen residu iki minangka glikosilasi sing disambung N.Struktur kasebut dumadi saka rong domain: bundle four-helix N-terminal (4HB) lan domain kaya Ig terminal C kanthi wilayah engsel penengah ing antarane (Fig. 1c).
Struktur domain ekstraselular SPACA6.Diagram Strip saka domain ekstraselular saka SPACA6, werna saka chain saka N kanggo C-terminus saka biru peteng kanggo abang peteng.Sistein sing ana ing ikatan disulfida disorot ing magenta.b Topologi domain ekstraselular SPACA6.Gunakake skema warna sing padha kaya ing Gambar 1a.c domain ekstraseluler SPACA6.Bagan jalur domain 4HB, engsel, lan Ig diwernani oranye, ijo, lan biru.Lapisan kasebut ora digambar kanthi skala.
Domain 4HB saka SPACA6 kalebu papat heliks utama (heliks 1-4), sing disusun kanthi bentuk heliks heliks (Gambar 2a), gantian antarane interaksi antiparalel lan paralel (Gambar 2b).A cilik tambahan siji-turn helix (helix 1′) dilebokake jejeg bundle, mbentuk segi telu karo helices 1 lan 2. Segitiga iki rada deformed ing helical-twisted packing relatif kandhel saka helices 3 lan 4 ( Gambar 2a).
4HB N-terminal strip bagan.b Tampilan ndhuwur bundel papat heliks, saben heliks disorot biru peteng ing N-terminus lan abang peteng ing C-terminus.c Diagram roda spiral ndhuwur-mudhun kanggo 4HB, kanthi saben residu ditampilake minangka bunder kanthi label kode asam amino siji-huruf;mung papat asam amino ing ndhuwur rodha sing nomer.Residu non-polar diwarnai kuning, residu polar sing ora diisi diwarnai ijo, residu sing bermuatan positif diwarnai biru, lan residu sing negatif diwarnai abang.d Rai segi telu saka domain 4HB, kanthi 4HBs ing oranye lan engsel ing ijo.Loro-lorone inset nuduhake ikatan disulfida sing bentuke rod.
4HB dikonsentrasi ing inti hidrofobik njero sing kasusun utamane saka residu alifatik lan aromatik (Gambar 2c).Inti ngandhut ikatan disulfida antarane Cys41 lan Cys55 sing nyambungake heliks 1 lan 2 bebarengan ing segitiga munggah ndhuwur (Fig. 2d).Rong ikatan disulfida tambahan dibentuk ing antarane motif CXXC ing Helix 1 'lan motif CXXC liyane sing ditemokake ing pucuk β-hairpin ing wilayah engsel (Gambar 2d).Residu arginin konservatif kanthi fungsi sing ora dingerteni (Arg37) dumunung ing njero segitiga kothong sing dibentuk dening heliks 1′, 1, lan 2. Atom karbon alifatik Cβ, Cγ, lan Cδ Arg37 sesambungan karo inti hidrofobik, lan gugus guanidine sawijining gerakan siklus. antarane helices 1 'lan 1 liwat interaksi antarane backbone Thr32 lan chain sisih (Fig. S5a, b).Tyr34 ngluwihi menyang growong ninggalake rong rongga cilik liwat kang Arg37 bisa sesambungan karo solvent.
Domain β-sandwich kaya Ig minangka superfamili gedhe saka protein sing nuduhake fitur umum saka rong utawa luwih lembar amphipathic multi-stranded sing interaksi liwat inti hidrofobik 39. Domain kaya Ig terminal-C saka SPACA6 nduweni pola sing padha. lan kasusun saka rong lapisan (Fig. S6a).Lembar 1 minangka β-sheet saka patang untaian (unai D, F, H, lan I) ing ngendi untaian F, H, lan I mbentuk susunan anti-paralel, lan untaian I lan D njupuk interaksi paralel.Tabel 2 minangka lembar beta stranded ganda anti-paralel cilik (unai E lan G).Ikatan disulfida internal diamati ing antarane C-terminus rantai E lan tengah rantai H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Ikatan disulfida iki padha karo ikatan disulfida ing domain β-sandwich immunoglobulin40,41.
Lembar β patang untai mlengkung ing sadawane dawane, mbentuk pinggiran asimetris sing beda-beda ing wangun lan elektrostatik.Pinggiran tipis punika lumahing lingkungan hidrofobik warata sing stands metu dibandhingake lumahing isih ora rata lan electrostatically macem-macem ing SPACA6 (Fig. S6b, c).A halo saka karbonil balung mburi kapapar gugus / amino lan rentengan sisih polar ngubengi lumahing hidrofobik (Fig. S6c).Margin sing luwih amba ditutupi dening segmen heliks sing ditutupi sing ngalangi bagean terminal-N saka inti hidrofobik lan mbentuk telung ikatan hidrogen karo gugus polar mbukak saka tulang punggung rantai F (Gbr. S6d).Bagian C-terminal pinggiran iki mbentuk kanthong gedhe karo inti hidrofobik sebagian kapapar.Kanthong kasebut diubengi dening muatan positif amarga telung set residu arginin ganda (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 lan Arg212-Arg214) lan histidine tengah (His220) (Gambar S6e).
Wilayah engsel minangka bagean cendhak ing antarane domain heliks lan domain kaya Ig, sing dumadi saka siji lapisan β telung untai antiparalel (unai A, B lan C), heliks cilik 310, lan sawetara segmen heliks acak dawa.(Gambar S7).Jaringan kontak kovalen lan elektrostatik ing wilayah engsel katon kanggo nyetabilake orientasi antarane 4HB lan domain kaya Ig.Jaringan bisa dipérang dadi telung bagéan.Pérangan pisanan kalebu rong motif CXXC (27CXXC30 lan 139CXXC142) sing mbentuk pasangan ikatan disulfida ing antarane β-hairpin ing engsel lan 1′ helix ing 4HB.Bagian kapindho kalebu interaksi elektrostatik antarane domain kaya Ig lan engsel.Glu132 ing engsel mbentuk jembatan uyah karo Arg233 ing domain kaya Ig lan Arg135 ing engsel.Bagian katelu kalebu ikatan kovalen antarane domain kaya Ig lan wilayah engsel.Rong ikatan disulfida (Cys124-Cys147 lan Cys128-Cys153) nyambungake daur ulang engsel menyang linker sing stabil kanthi interaksi elektrostatik antarane Gln131 lan gugus fungsi backbone, ngidini akses menyang domain kaya Ig pisanan.rante.
Struktur ectodomain SPACA6 lan struktur individu saka domain kaya 4HB lan Ig digunakake kanggo nggoleki cathetan struktur sing padha ing basis data protein 42.Kita nemtokake pertandhingan kanthi skor Dali Z sing dhuwur, simpangan standar cilik, lan skor LALI sing gedhe (sing terakhir yaiku jumlah residu sing padha karo struktur).Nalika 10 hits pisanan saka telusuran ectodomain lengkap (Tabel S1) nduweni skor Z sing bisa ditampa > 842, panelusuran kanggo domain kaya 4HB utawa Ig mung nuduhake yen paling akeh hits iki mung cocog karo β-sandwich.lipatan ing ngendi-endi sing ditemokake ing pirang-pirang protein.Telung telusuran ing Dali mung ngasilake siji asil: IZUMO1.
Wis suwe disaranake yen SPACA6 lan IZUMO1 nuduhake persamaan struktural7,32,37.Sanajan ectodomain saka loro protein sing digandhengake karo fusi gamet iki mung nuduhake identitas urutan 21% (Gambar S8a), bukti sing kompleks, kalebu pola ikatan disulfida sing dikonservasi lan domain kaya Ig terminal C sing diprediksi ing SPACA6, ngidini upaya awal kanggo mbangun a model homologi saka A lan SPACA6 mouse nggunakake IZUMO1 minangka template37.Struktur kita negesake prediksi kasebut lan nuduhake tingkat persamaan sing bener.Nyatane, struktur SPACA6 lan IZUMO137,43,44 nuduhake arsitektur rong domain sing padha (Gambar S8b) karo domain β-sandwich kaya 4HB lan Ig sing disambungake dening wilayah engsel (Gbr. S8c).
IZUMO1 lan SPACA6 4HB duwe beda umum saka bundel spiral konvensional.4HBs khas, kaya sing ditemokake ing kompleks protein SNARE sing melu fusi endosom 45,46, duwe heliks kanthi jarak rata sing njaga kelengkungan konstan ing sumbu tengah 47. Ing kontras, domain heliks ing IZUMO1 lan SPACA6 distorsi, kanthi kelengkungan variabel lan packing ora rata (Gambar S8d).Puteran, sing mbokmenawa disebabake dening segi telu sing dibentuk dening heliks 1 ', 1 lan 2, ditahan ing IZUMO1 lan SPACA6 lan distabilake kanthi motif CXXC sing padha ing heliks 1'.Nanging, ikatan disulfida tambahan sing ditemokake ing SPACA6 (Cys41 lan Cys55 kanthi kovalen ngubungake heliks 1 lan 2 ing ndhuwur) nggawe puncak sing luwih cetha ing pucuk segitiga, nggawe SPACA6 luwih bengkong tinimbang IZUMO1, kanthi segitiga rongga sing luwih jelas.Kajaba iku, IZUMO1 ora duwe Arg37 sing diamati ing tengah rongga iki ing SPACA6.Ing kontras, IZUMO1 nduweni inti hidrofobik sing luwih khas saka residu alifatik lan aromatik.
IZUMO1 nduweni domain kaya Ig sing kasusun saka β-sheet untai ganda lan lima untaian β43.Untai ekstra ing IZUMO1 ngganti kumparan ing SPACA6, sing sesambungan karo untaian F kanggo matesi ikatan hidrogen balung mburi ing untaian.Titik perbandingan sing menarik yaiku prediksi muatan permukaan domain kaya Ig saka rong protein kasebut.Lumahing IZUMO1 luwih akeh muatan negatif tinimbang lumahing SPACA6.Muatan tambahan dumunung ing cedhak terminal C sing madhep membran sperma.Ing SPACA6, wilayah sing padha luwih netral utawa muatan positif (Fig. S8e).Contone, lumahing hidrofobik (pinggiran luwih tipis) lan pit muatan positif (pinggiran sing luwih jembar) ing SPACA6 muatan negatif ing IZUMO1.
Senajan hubungan lan unsur struktur sekunder antarane IZUMO1 lan SPACA6 uga wadi, Alignment struktural saka domain Ig-kaya nuduhake yen loro domain beda-beda ing orientasi umum relatif kanggo saben liyane (Fig. S9).Bundel spiral IZUMO1 mlengkung babagan β-sandwich, nggawe wangun "boomerang" sing sadurunge diterangake ing babagan 50 ° saka sumbu tengah.Ing kontras, balok heliks ing SPACA6 diiringake kira-kira 10 ° ing arah ngelawan.Beda ing orientasi kasebut kemungkinan amarga beda ing wilayah engsel.Ing tingkat urutan utami, IZUMO1 lan SPACA6 nuduhake persamaan urutan cilik ing engsel, kajaba residu sistein, glisin, lan asam aspartat.Akibaté, ikatan hidrogen lan jaringan elektrostatik beda banget.Unsur struktur sekunder β-sheet dienggo bareng karo IZUMO1 lan SPACA6, sanajan ranté ing IZUMO1 luwih dawa lan heliks 310 (helix 5) unik kanggo SPACA6.Bedane iki nyebabake orientasi domain sing beda kanggo rong protein sing padha.
Panelusuran server Dali kita ngandhakake yen SPACA6 lan IZUMO1 mung rong struktur sing ditemtokake sacara eksperimen sing disimpen ing basis data protein sing duwe lipatan 4HB tartamtu (Tabel S1).Paling anyar, DeepMind (Alphabet/Google) wis ngembangake AlphaFold, sistem basis jaringan saraf sing bisa prédhiksi struktur 3D protein saka urutan utami48 kanthi akurat.Sakcepete sawise kita ngrampungake struktur SPACA6, database AlphaFold dirilis, nyedhiyakake model struktur prediktif sing nyakup 98,5% kabeh protein ing proteome manungsa48,49.Nggunakake struktur SPACA6 sing wis ditanggulangi minangka model telusuran, telusuran homologi struktural kanggo model ing proteome manungsa AlphaFold ngidhentifikasi calon kanthi kemungkinan struktural sing padha karo SPACA6 lan IZUMO1.Given akurasi luar biasa AlphaFold ing prédhiksi SPACA6 (Fig. S10a) -utamané 1.1 Å rms ectodomain dibandhingake struktur mantun kita (Fig. S10b) -kita bisa manteb ing ati sing cocog SPACA6 dikenali kamungkinan akurat.
Sadurungé, PSI-BLAST nggolèki kluster IZUMO1 kanthi telung protein sing ana hubungane karo sperma: IZUMO2, IZUMO3, lan IZUMO450.AlphaFold prédhiksi manawa protein kulawarga IZUMO iki melu ing domain 4HB kanthi pola ikatan disulfida sing padha karo IZUMO1 (Gambar 3a lan S11), sanajan ora duwe domain kaya Ig.Dianggep yen IZUMO2 lan IZUMO3 minangka protein membran siji-sisi sing padha karo IZUMO1, dene IZUMO4 katon disekresi.Fungsi protein IZUMO 2, 3, lan 4 ing fusi gamet durung ditemtokake.IZUMO3 dikenal nduweni peran ing biogenesis akrosom sajrone perkembangan sperma51 lan protein IZUMO ditemokake mbentuk kompleks50.Konservasi protèin IZUMO ing mamalia, reptil, lan amfibi nuduhaké yèn fungsi potensialé selaras karo protèin liya sing digandhengake karo gamet-fusion, kayata DCST1/2, SOF1, lan FIMP.
Diagram arsitektur domain saka superfamili IST, kanthi domain 4HB, engsel, lan kaya Ig sing disorot kanthi warna oranye, ijo, lan biru.IZUMO4 nduweni wilayah C-terminal unik sing katon ireng.Ikatan disulfida sing dikonfirmasi lan putative dituduhake kanthi garis sing padhet lan garis putus-putus.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM95), lan DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) ditampilake ing sawetara werna padha panel A. Ikatan disulfida ditampilake ing magenta.Heliks transmembrane TMEM95, IZUMO2 lan IZUMO3 ora ditampilake.
Ora kaya protein IZUMO, protein SPACA liyane (yaiku, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, lan SPACA9) dianggep struktural beda karo SPACA6 (Fig. S12).Mung SPACA9 duwe 4HB, nanging ora samesthine duwe orientasi podo-anti-paralel padha utawa ikatan disulfida padha SPACA6.Mung SPACA1 sing duwe domain kaya Ig sing padha.AlphaFold prédhiksi sing SPACA3, SPACA4 lan SPACA5 duwe struktur temen beda saka SPACA6.Apike, SPACA4 uga dikenal nduweni peran ing pembuahan, nanging luwih akeh tinimbang SPACA6, tinimbang nggampangake interaksi antarane sperma lan oosit zona pellucida52.
Panelusuran AlphaFold kita nemokake match liyane kanggo IZUMO1 lan SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, protein transmembrane spesifik sperma tunggal, ndadekake tikus lanang ora subur nalika ablated 32,33.Spermatozoa sing kurang TMEM95 nduweni morfologi normal, motilitas, lan kemampuan kanggo nembus zona pellucida lan ikatan menyang membran endhog, nanging ora bisa gabung karo membran oosit.Panaliten sadurunge wis nuduhake yen TMEM95 duwe persamaan struktural karo IZUMO133.Pancen, model AlphaFold dikonfirmasi yen TMEM95 minangka 4HB kanthi pasangan motif CXXC sing padha karo IZUMO1 lan SPACA6 lan ikatan disulfida tambahan sing padha antarane heliks 1 lan 2 sing ditemokake ing SPACA6 (Fig. 3a lan S11).Senajan TMEM95 ora duwe domain kaya Ig, nanging nduweni wilayah kanthi pola ikatan disulfida sing padha karo wilayah engsel SPACA6 lan IZUMO1 (Gambar 3b).Nalika nerbitake naskah iki, server preprint nglaporake struktur TMEM95, ngonfirmasi asil AlphaFold53.TMEM95 banget padha karo SPACA6 lan IZUMO1 lan évolusi wis dikonservasi ing amfibi (Fig. 4 lan S13).
Panelusuran PSI-BLAST nggunakake database NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, lan SOF1 kanggo nemtokake posisi urutan kasebut ing wit urip.Jarak antarane titik cabang ora ditampilake kanggo skala.
Persamaan struktural sakabèhé ing antarane SPACA6 lan IZUMO1 nuduhake manawa dheweke dadi anggota saka superfamili struktural sing dikonservasi sing kalebu protein TMEM95 lan IZUMO 2, 3, lan 4.anggota dikenal: IZUMO1, SPACA6 lan TMEM95.Amarga mung sawetara anggota sing duwe domain kaya Ig, ciri khas saka superfamili IST yaiku domain 4HB, sing nduweni fitur unik sing umum kanggo kabeh protein kasebut: 1) Coiled 4HB kanthi heliks sing disusun kanthi gantian anti-paralel / paralel (Gbr. . 5a), 2) bundel kasebut nduweni pasuryan segi telu sing dumadi saka rong heliks ing njero bundel lan heliks vertikal katelu (Gambar area kunci (Gambar 5c). Motif CXXC, sing ditemokake ing protein kaya thioredoxin, dikenal kanthi fungsi. minangka sensor redoks 54,55,56, dene motif ing anggota kulawarga IST bisa digandhengake karo isomerase protein disulfida kayata ERp57 ing fusi gamet. Peran digandhengake karo 57,58.
Anggota superfamili IST ditetepake kanthi telung fitur karakteristik domain 4HB: papat heliks bolak-balik antarane orientasi paralel lan antiparalel, pasuryan bundle helical ba-triangular, lan motif ganda ca CXXC sing dibentuk ing antarane molekul cilik.) Heliks terminal N (oranye) lan wilayah engsel β-jepit rambut (ijo).
Amarga mirip antarane SPACA6 lan IZUMO1, kemampuan mantan kanggo ikatan karo IZUMO1 utawa JUNO dites.Biolayer interferometry (BLI) minangka cara ikatan adhedhasar kinetik sing sadurunge digunakake kanggo ngitung interaksi antarane IZUMO1 lan JUNO.Sawise inkubasi sensor biotin-label karo IZUMO1 minangka umpan kanthi konsentrasi analit JUNO sing dhuwur, sinyal sing kuwat dideteksi (Fig. S14a), nuduhake owah-owahan sing digandhengake karo kekandelan biomaterial sing dipasang ing ujung sensor.Sinyal sing padha (IE, JUNO digandhengake karo sensor minangka umpan marang analit IZUMO1) (Fig. S14b).Ora ana sinyal sing dideteksi nalika SPACA6 digunakake minangka analit marang IZUMO1 sensor-bound utawa JUNO sensor-bound (Gambar S14a, b).Ora ana sinyal iki nuduhake yen domain ekstraselular SPACA6 ora sesambungan karo domain ekstraselular IZUMO1 utawa JUNO.
Amarga tes BLI adhedhasar biotinilasi residu lisin gratis ing protein umpan, modifikasi iki bisa nyegah ikatan yen residu lisin melu interaksi.Kajaba iku, orientasi ikatan relatif marang sensor bisa nggawe alangan sterik, mula tes tarik-mudhun konvensional uga ditindakake ing ectodomains SPACA6, IZUMO1 lan JUNO rekombinan.Senadyan mangkono, SPACA6 ora precipitate karo IZUMO1 sing diwenehi tag utawa JUNO sing diwenehi tag (Fig. S14c, d), nuduhake ora ana interaksi sing konsisten karo sing diamati ing eksperimen BLI.Minangka kontrol positif, kita dikonfirmasi interaksi JUNO karo labeled Kang IZUMO1 (Tokoh S14e lan S15).
Senadyan mirip struktural antarane SPACA6 lan IZUMO1, ora bisa nggumunake SPACA6 kanggo ngiket JUNO.Lumahing IZUMO1 manungsa nduweni luwih saka 20 residu sing sesambungan karo JUNO, kalebu residu saka saben telung wilayah kasebut (sanajan umume ana ing wilayah engsel) (Fig. S14f).Saka residu kasebut, mung siji sing disimpen ing SPACA6 (Glu70).Nalika akeh substitusi ampas nahan sipat biokimia asli, residu Arg160 sing penting ing IZUMO1 diganti karo Asp148 sing bermuatan negatif ing SPACA6;pasinaon sadurungé wis ditampilake sing mutasi Arg160Glu ing IZUMO1 meh rampung abolishes naleni kanggo JUNO43.Kajaba iku, prabédan ing orientasi domain antarane IZUMO1 lan SPACA6 sacara signifikan nambah area lumahing situs JUNO-binding saka wilayah sing padha ing SPACA6 (Fig. S14g).
Senadyan perlu SPACA6 kanggo fusi gamet lan mirip karo IZUMO1, SPACA6 ora katon duwe fungsi naleni JUNO sing padha.Mula, kita wis ngupaya nggabungake data struktural kita kanthi bukti pentinge sing diwenehake dening biologi evolusi.Alignment urutan homolog SPACA6 nuduhake konservasi struktur umum ngluwihi mamalia.Contone, residu sistein ana sanajan ing amfibi sing ana hubungane (Gambar 6a).Nggunakake server ConSurf, sawetara data retensi alignment urutan saka 66 urutan padha dipetakan menyang lumahing SPACA6.Analisis jinis iki bisa nuduhake residu endi sing disimpen sajrone evolusi protein lan bisa nuduhake wilayah permukaan endi sing duwe peran ing fungsi kasebut.
a Alignment urutan saka ectodomains SPACA6 saka 12 spesies beda disiapake nggunakake CLUSTAL OMEGA.Miturut analisis ConSurf, posisi paling konservatif ditandhani biru.Sisa sistein disorot kanthi warna abang.Wates domain lan unsur struktur sekunder ditampilake ing sisih ndhuwur alignment, ing ngendi panah nuduhake β-strands lan gelombang nuduhake heliks.Pengenal Akses NCBI sing ngemot urutan kasebut yaiku: manungsa (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), monyet capuchin (mimik Cebu, XP_017359366), jaran (Equus caballus, XP52_02rcallus), jaran (Equus caballus. 3 XP_032_034).), wedhus (Ovis aries, XP_014955560), gajah (Loxodonta africana, XP_010585293), asu (Canis lupus familyis, XP_025277208), tikus (Mus musculus, NP_001156381) ypus, 8) , 61_89 lan Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nomer kasebut adhedhasar urutan manungsa.b Perwakilan lumahing struktur SPACA6 karo 4HB ing ndhuwur lan domain Ig-kaya ing ngisor, werna adhedhasar prakiraan konservasi saka server ConSurf.Bagean sing diawetake paling apik yaiku warna biru, bagean sing diawetake kanthi warna putih, lan sing paling ora disimpen yaiku warna kuning.sistein ungu.Telung patches lumahing nuduhake tingkat dhuwur saka pangayoman ditampilake ing inset labeled patch 1, 2 lan 3. Kartun 4HB ditampilake ing inset ing sisih tengen ndhuwur (skema werna padha).
Struktur SPACA6 wis telung wilayah lumahing banget lestari (Fig. 6b).Patch 1 kalebu 4HB lan wilayah engsel lan ngemot loro kreteg disulfida CXXC sing dikonservasi, jaringan engsel Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), lan telung residu aromatik njaba sing disimpen (Phe31, Tyr73, Phe137)).rim luwih akeh saka domain Ig-kaya (Fig. S6e), kang makili sawetara ampas positif ing lumahing sperma.Apike, tembelan iki ngemot epitope antibodi sing sadurunge wis ditampilake ngganggu fungsi SPACA6 30.Wilayah 3 nyakup engsel lan sisih siji saka domain kaya Ig;wilayah iki ngandhut prolines lestari (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) lan polar madhep njaba / ampas daya.Kaget, paling saka residu ing lumahing 4HB banget maneko rupo (Fig. 6b), senajan lipatan iki lestari saindhenging homolog SPACA6 (minangka dituduhake dening conservatism saka inti bundel hidrofobik) lan ngluwihi superfamili IST.
Sanajan iki minangka wilayah paling cilik ing SPACA6 kanthi unsur struktur sekunder sing paling sithik sing bisa dideteksi, akeh sisa-sisa wilayah engsel (kalebu wilayah 3) banget dikonservasi ing antarane homolog SPACA6, sing bisa uga nuduhake yen orientasi bundle heliks lan β-sandwich nduweni peran.minangka konservatif.Nanging, senadyan ikatan hidrogen lan jaringan elektrostatik ekstensif ing wilayah engsel SPACA6 lan IZUMO1, bukti keluwesan intrinsik bisa dideleng ing alignment saka macem-macem struktur sing diijini IZUMO137,43,44.Alignment saka domain individu tumpang tindih uga, nanging orientasi saka domain relatif kanggo saben liyane beda-beda saka 50 ° kanggo 70 ° saka sumbu tengah (Fig. S16).Kanggo mangerteni dinamika konformasi SPACA6 ing solusi, eksperimen SAXS ditindakake (Gambar S17a, b).Ab initio reconstruction saka ectodomain SPACA6 salaras karo struktur kristal rod (Fig. S18), sanajan plot Kratky nuduhake sawetara tingkat keluwesan (Fig. S17b).Konformasi iki kontras karo IZUMO1, ing ngendi protein sing ora kaiket nganggep wujud bumerang ing kisi lan ing larutan43.
Kanggo nemtokake khusus wilayah fleksibel, spektroskopi massa pertukaran hidrogen-deuterium (H-DXMS) ditindakake ing SPACA6 lan dibandhingake karo data sing sadurunge dipikolehi ing IZUMO143 (Gambar 7a, b).SPACA6 jelas luwih fleksibel tinimbang IZUMO1, sing dibuktekake kanthi ijol-ijolan deuterium sing luwih dhuwur ing saindhenging struktur sawise ijol-ijolan 100.000 detik.Ing loro struktur kasebut, bagean terminal C saka wilayah engsel nuduhake tingkat ijol-ijolan sing dhuwur, sing mbokmenawa ngidini rotasi winates saka domain 4HB lan Ig-kaya relatif kanggo saben liyane.Apike, bagean C-terminal saka engsel SPACA6, dumadi saka 147CDLPLDCP154 ampas, punika wilayah banget lestari 3 (Fig. 6b), bisa nuduhake yen keluwesan interdomain minangka fitur évolusionèr konservasi saka SPACA6.Miturut analisis keluwesan, data leleh termal CD nuduhake yen SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) kurang stabil tinimbang IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) (Gambar S1e lan S19).
gambar H-DXMS saka SPACA6 lan b IZUMO1.Persentase ijol-ijolan deuterium ditemtokake ing titik wektu sing dituduhake.Tingkat pertukaran hidrogen-deuterium dituduhake kanthi werna ing skala gradien saka biru (10%) nganti abang (90%).Kothak ireng makili wilayah ijol-ijolan dhuwur.Wates 4HB, engsel lan domain kaya Ig sing diamati ing struktur kristal ditampilake ing ndhuwur urutan utami.Tingkat pertukaran Deuterium ing 10 s, 1000 s, lan 100.000 s diplot ing bagan strip sing ditumpangake ing permukaan molekul transparan SPACA6 lan IZUMO1.Bagean struktur kanthi tingkat pertukaran deuterium ing ngisor 50% diwarnai putih.Wilayah ing ndhuwur 50% ijol-ijolan H-DXMS diwarnai kanthi skala gradien.
Panganggone strategi genetis knockout gen CRISPR / Cas9 lan tikus wis nyebabake identifikasi sawetara faktor sing penting kanggo ikatan lan fusi sperma lan endhog.Kajaba saka interaksi struktur IZUMO1-JUNO lan CD9 sing diciriake kanthi apik, sebagian besar protein sing ana gandhengane karo fusi gamet tetep struktural lan fungsional enigmatic.Karakterisasi biofisik lan struktur SPACA6 minangka potongan liyane saka teka-teki molekuler adhesi / fusi sajrone pembuahan.
SPACA6 lan anggota superfamili IST liyane katon banget konservasi ing mamalia uga manuk individu, reptil, lan amfibi;nyatane, dikira SPACA6 malah dibutuhake kanggo pembuahan ing zebrafish 59. Distribusi iki padha karo protein liyane sing digandhengake karo fusi gamet kayata DCST134, DCST234, FIMP31, lan SOF132, sing nuduhake yen faktor kasebut kekurangan HAP2 (uga dikenal minangka GCS1) protein sing tanggung jawab kanggo aktivitas katalitik saka akeh protista., tetanduran, lan arthropoda.Protein fusi sing dibuahi 60, 61. Senadyan mirip struktural sing kuat antarane SPACA6 lan IZUMO1, kalah saka gen enkoding salah siji saka protein kasebut nyebabake infertilitas ing tikus lanang, sing nuduhake yen fungsi ing fusi gamet ora diduplikasi..Luwih umum, ora ana protein sperma sing dikenal sing dibutuhake kanggo fase adhesi fusi sing berlebihan.
Iku tetep dadi pitakonan mbukak apa SPACA6 (lan anggota superfamili IST liyane) melu ing persimpangan intergametic, mbentuk jaringan intragametic kanggo Recruit protein penting kanggo titik fusi, utawa mbok menawa malah tumindak minangka fusogens angel dipahami.Pasinaon co-immunoprecipitation ing sel HEK293T nuduhake interaksi antarane IZUMO1 lan SPACA632 sing dawa lengkap.Nanging, ectodomains rekombinan kita ora interaksi in vitro, nuduhake yen interaksi katon ing Noda et al.loro-lorone dibusak ing konstruksi (cathetan buntut sitoplasma IZUMO1, sing wis dituduhake ora perlu kanggo pembuahan62).Utawa, IZUMO1 lan/utawa SPACA6 bisa uga mbutuhake lingkungan pangiket tartamtu sing ora kita reproduksi in vitro, kayata konformasi spesifik fisiologis utawa kompleks molekul sing ngemot protein liyane (dikenal utawa durung ditemokake).Senajan ectodomain IZUMO1 diyakini dadi mediasi lampiran spermatozoa menyang endhog ing ruang perivitelline, tujuan ectodomain SPACA6 ora jelas.
Struktur SPACA6 nuduhake sawetara permukaan sing dikonservasi sing bisa uga ana ing interaksi protein-protein.Bagian sing dikonservasi saka wilayah engsel sing langsung cedhak karo motif CXXC (ditetepake Patch 1 ing ndhuwur) nduweni sawetara residu aromatik sing madhep njaba sing asring digandhengake karo interaksi hidrofobik lan π-numpuk ing antarane biomolekul.Sisih amba saka domain Ig-kaya (wilayah 2) mbentuk alur muatan positif karo Arg banget lestari lan residu His, lan antibodi marang wilayah iki sadurunge wis digunakake kanggo mblokir fusi gamet 30.Antibodi kasebut ngenali epitope linier 212RIRPAQLTHRGTFS225, sing nduweni telu saka enem residu arginin lan His220 sing dijaga banget.Ora jelas manawa disfungsi kasebut amarga pamblokiran residu spesifik kasebut utawa kabeh wilayah.Lokasi celah iki ing cedhak C-terminus saka β-sandwich nuduhake cis-interaksi karo protein sperma tetanggan, nanging ora karo protein oosit.Salajengipun, penylametan kusut kaya proline sing fleksibel banget (situs 3) ing engsel bisa dadi situs interaksi protein-protein utawa, luwih cenderung, nuduhake retensi keluwesan ing antarane rong domain kasebut.Gender penting kanggo peran SPACA6 sing ora dingerteni.fusi saka gamet.
SPACA6 nduweni sifat protein adhesi antarsel, kalebu β-sandwich kaya Ig.Akeh protèin adesif (contone, cadherin, integrin, adhesin, lan IZUMO1) nduweni siji utawa luwih domain β-sandwich sing ngluwihi protein saka membran sel menyang target lingkungane63,64,65.Domain kaya Ig saka SPACA6 uga ngemot motif sing umum ditemokake ing β-sandwich saka adhesi lan kohesi: dobel saka untaian paralel ing ujung β-sandwich, sing dikenal minangka clamps mekanik66.Dipercaya manawa motif iki nambah resistensi kanggo gaya geser, sing penting kanggo protein sing melu interaksi antarsel.Nanging, senadyan mirip karo adhesin, saiki ora ana bukti yen SPACA6 sesambungan karo putih endhog.Ectodomain SPACA6 ora bisa ikatan karo JUNO, lan sel HEK293T sing ekspresi SPACA6, kaya sing dituduhake ing kene, meh ora bisa berinteraksi karo oosit sing ora duwe zona 32.Yen SPACA6 nggawe ikatan intergametic, interaksi kasebut mbutuhake modifikasi pasca-translasi utawa distabilake dening protein sperma liyane.Kanggo ndhukung hipotesis sing terakhir, spermatozoa sing kekurangan IZUMO1 ikatan karo oosit, nuduhake yen molekul liyane saka IZUMO1 melu ing langkah adhesi gamet 27.
Akeh protèin fusi virus, selular, lan perkembangan duwé sipat sing prédhiksi fungsiné minangka fusogens.Contone, glikoprotein fusi virus (kelas I, II lan III) duwe peptida fusi hidrofobik utawa loop ing pungkasan protein sing dilebokake ing membran inang.Peta hidrofilisitas IZUMO143 lan struktur (ditemtokake lan diprediksi) saka superfamili IST ora nuduhake peptida fusi hidrofobik sing katon.Mangkono, yen ana protèin ing superfamili IST sing fungsi minangka fusogens, padha nindakake kanthi cara sing beda karo conto liyane sing dikenal.
Kesimpulane, fungsi anggota superfamili IST saka protein sing ana gandhengane karo fusi gamet tetep dadi misteri sing nyenengake.Molekul rekombinan SPACA6 kita lan struktur sing wis ditemtokake bakal menehi wawasan babagan hubungan antarane struktur sing dienggo bareng iki lan perane ing lampiran lan fusi gamet.
Urutan DNA sing cocog karo ectodomain SPACA6 manungsa sing diprediksi (nomer akses NCBI NP_001303901.1; residu 27-246) dioptimalake kodon kanggo ekspresi ing sel Drosophila melanogaster S2 lan disintesis minangka fragmen gen kanthi urutan enkoding Kozak (Eurofins Genomics)., sinyal sekresi BiP lan 5 'lan 3' sing cocog kanggo kloning bebas ligation saka gen iki dadi vektor ekspresi pMT adhedhasar promotor metallothionein sing diowahi kanggo pilihan karo puromycin (pMT-puro).Vektor pMT-puro ngode situs pembelahan trombin diikuti tag C-terminal 10x-His (Gambar S2).
Transfeksi stabil saka vektor SPACA6 pMT-puro menyang sel D. melanogaster S2 (Gibco) ditindakake kanthi cara sing padha karo protokol sing digunakake kanggo IZUMO1 lan JUNO43.Sel S2 dilebur lan ditanam ing medium Schneider (Gibco) ditambah karo konsentrasi akhir 10% (v/v) serum pedhet janin sing ora aktif panas (Gibco) lan 1X antibiotik antimikotik (Gibco).Sel awal (3,0 x 106 sel) dilapisi ing sumur individu saka plat 6 sumur (Corning).Sawise 24 jam inkubasi ing 27 ° C, sel ditransfeksi kanthi campuran 2 mg vektor SPACA6 pMT-puro lan reagen transfeksi Effectene (Qiagen) miturut protokol pabrikan.Sel sing ditransmisikan diinkubasi suwene 72 jam banjur dipanen nganggo puromisin 6 mg/ml.Sèl banjur diisolasi saka medium Schneider sing lengkap lan diselehake ing medium Insect-XPRESS (Lonza) gratis serum kanggo produksi protein skala gedhe.Kultur sel S2 batch 1 L ditanam dadi 8-10 × 106 ml-1 sel ing labu Erlenmeyer polipropilena flat-bottomed ventilated 2 L banjur disterilisasi kanthi konsentrasi akhir 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) lan disaring steril.induksi.Kultur sing diinduksi diinkubasi ing 27 ° C. ing 120 rpm suwene patang dina.
Media kahanan sing ngemot SPACA6 diisolasi kanthi sentrifugasi ing 5660 × g ing 4 ° C diikuti karo sistem filtrasi aliran tangensial Centramate (Pall Corp) kanthi membran MWCO 10 kDa.Aplikasiake medium konsentrasi sing ngemot SPACA6 menyang kolom resin agarose (Qiagen) 2 ml Ni-NTA.Resin Ni-NTA dikumbah nganggo 10 volume kolom (CV) buffer A lan banjur ditambahake 1 CV buffer A kanggo menehi konsentrasi imidazole pungkasan 50 mM.SPACA6 diencerake kanthi 10 ml buffer A sing ditambah karo imidazole nganti konsentrasi akhir 500 mM.Thrombin kelas Watesan (Millipore Sigma) ditambahake langsung menyang tubing dialisis (MWCO 12-14 kDa) ing 1 unit saben mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 lan 150 mM NaCl (buffer B) kanggo dialisis.) ing 4°C suwene 48 jam.SPACA6 sing dibelah thrombin banjur diencerake kaping telu kanggo nyuda konsentrasi uyah lan dimuat ing kolom pertukaran kation MonoS 5/50 GL 1 ml (Cytiva/GE) sing diimbangi karo 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Penukar kation dicuci nganggo 3 CV saka 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, banjur SPACA6 diencerake kanthi gradien linier 0 nganti 500 mM NaCl ing 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 kanggo 25 CV.Sawise kromatografi ion exchange, SPACA6 iki klempakan kanggo 1 ml lan eluted isocratically saka kolom ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibrated karo buffer B. Miturut kromatogram, blumbang lan konsentrasi pecahan ngemot SPACA6.Kemurnian dikontrol dening elektroforesis Coomassie-stained ing gel SDS-polyacrylamide 16%.Konsentrasi protein diukur kanthi absorbansi ing 280 nm nggunakake hukum Beer-Lambert lan koefisien kepunahan molar teoretis.
SPACA6 sing diresiki didialisis sewengi nglawan 10 mM natrium fosfat, pH 7,4 lan 150 mM NaF lan diencerke nganti 0,16 mg / mL sadurunge dianalisis kanthi spektroskopi CD.Pemindaian spektral CD kanthi dawa gelombang 185 nganti 260 nm diklumpukake ing spektropolarimeter Jasco J-1500 nggunakake cuvettes kuarsa kanthi dawa jalur optik 1 mm (Helma) ing 25 ° C kanthi kecepatan 50 nm / min.Spektrum CD dikoreksi, rata-rata luwih saka 10 akuisisi, lan diowahi dadi ellipticity residual tegese (θMRE) ing derajat cm2 / dmol:
ing ngendi MW yaiku bobot molekul saben sampel ing Da;N minangka jumlah asam amino;θ yaiku ellipticity ing milidegree;d cocog karo dawa path optik ing cm;konsentrasi protein ing unit.