304 Stainless steel dilas tabung melingkar/tabung zhemical zompon, Potensi Biosintetik dari Global Marine Microbiome

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Slider nuduhake telung artikel saben slide.Gunakake tombol mburi lan sabanjuré kanggo mindhah liwat minger, utawa tombol controller geser ing mburi kanggo mindhah liwat saben geser.

Katrangan produk rinci

304 Stainless steel dilas tabung coiled / tubing
1. Spesifikasi: Stainless steel coil tube/tubing
2. Tipe: gandheng utawa rapi
3. Standar: ASTM A269, ASTM A249
4. Stainless steel coil tabung OD: 6mm kanggo 25.4MM
5. Length: 600-3500MM utawa minangka saben requirement customer kang.
6. Kekandelan tembok: 0.2mm kanggo 2.0mm.

7. Toleransi: OD: +/-0.01mm;Kekandelan: +/- 0,01%.

8. Coil ukuran bolongan utama: 500MM-1500MM (bisa diatur miturut syarat customer)

9. dhuwur Coil: 200MM-400MM (bisa diatur miturut syarat customer)

10. Lumahing: Padhang utawa annealed
11. Bahan: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, alloy 625, 825, 2205, 2507, lsp.
12. Packing: tas anyaman ing kasus kayu, pallet kayu, batang kayu, utawa minangka saben requirement customer kang
13. Tes: komponen kimia, kekuatan ngasilake, kekuatan tarik, pangukuran kekerasan
14. Jaminan: Inspeksi pihak katelu (contone: SGS TV), lsp.
15. Aplikasi: Dekorasi, Furnitur, transportasi lenga, exchanger panas, Railing nggawe, nggawe kertas, mobil, Processing pangan, medical, etc.

Komunitas mikroba alam sacara filogenetik lan macem-macem metabolisme.Saliyane klompok organisme1 sing durung ditliti, keragaman iki uga nduweni potensi sing sugih kanggo panemuan enzim lan senyawa biokimia sing signifikan sacara ekologis lan bioteknologis2,3.Nanging, nyinaoni keragaman iki kanggo nemtokake jalur genomik sing nyintesis senyawa kasebut lan ngiket karo inang masing-masing tetep dadi tantangan.Potensi biosintesis mikroorganisme ing segara mbukak ora dingerteni amarga ana watesan ing analisis data resolusi genom ing skala global.Ing kene, kita njelajah macem-macem lan macem-macem klompok gen biosintetik ing segara kanthi nggabungake udakara 10.000 genom mikroba saka sel kultur lan sel tunggal kanthi luwih saka 25.000 draf genome sing mentas direkonstruksi saka luwih saka 1.000 conto banyu laut.Upaya iki wis nemtokake kira-kira 40.000 kluster gen biosintetik sing biasane anyar, sawetara sing ditemokake ing klompok filogenetik sing ora diduga sadurunge.Ing populasi kasebut, kita nemtokake garis keturunan sing diperkaya ing kluster gen biosintetik ("Candidatus Eudormicrobiaceae") sing kalebu ing filum bakteri sing ora dibudidaya lan kalebu sawetara mikroorganisme sing paling maneka warna biosintesis ing lingkungan iki.Saka jumlah kasebut, kita duwe ciri jalur fosfatase-peptida lan pytonamide, ngenali kedadeyan struktur senyawa bioaktif lan enzimologi sing ora biasa.Kesimpulane, panliten iki nuduhake kepiye strategi adhedhasar mikrobioma bisa ngaktifake eksplorasi enzim lan panganan alami sing durung dingerteni sadurunge ing mikrobiota lan lingkungan sing ora dingerteni.
Mikroba nyurung siklus biogeokimia global, njaga jaring pangan, lan njaga kesehatan tanduran lan kewan5.Keragaman filogenetik, metabolik lan fungsional sing gedhe banget nuduhake potensial sing sugih kanggo panemuan taksonomi1, enzim lan senyawa biokimia anyar, kalebu produk alami6.Ing komunitas ekologis, molekul kasebut nyedhiyakake mikroorganisme kanthi macem-macem fungsi fisiologis lan ekologis, saka komunikasi nganti kompetisi 2, 7.Saliyane fungsi asline, produk alami iki lan jalur produksi kode genetis menehi conto kanggo aplikasi bioteknologi lan terapeutik2,3.Identifikasi jalur lan sambungan kasebut wis difasilitasi banget kanthi sinau babagan mikroba kultur.Nanging, studi taksonomi lingkungan alam wis nuduhake yen akeh mikroorganisme durung dibudidayakake8.Bias budaya iki mbatesi kemampuan kita kanggo ngeksploitasi keragaman fungsional sing dikode dening akeh mikroba4,9.
Kanggo ngatasi watesan kasebut, kemajuan teknologi sajrone dasawarsa kepungkur ngidini para peneliti bisa langsung (yaiku, tanpa budaya sadurunge) ngurutake fragmen DNA mikroba saka kabeh komunitas (metagenomik) utawa sel tunggal.Kemampuan kanggo ngumpulake fragmen kasebut dadi pecahan genom sing luwih gedhe lan mbangun maneh genom sing dirakit metagenomik (MAG) utawa genom sing dikuatake tunggal (SAG), mbukak kesempatan penting kanggo studi taksonentrik mikrobioma (yaiku komunitas mikroba lan mikrobioma).mbukak dalan anyar.materi genetik dhewe ing lingkungan tartamtu) 10,11,12.Pancen, panaliten anyar wis ngembangake perwakilan filogenetik saka keragaman mikroba ing Bumi1, 13 lan wis ngumumake akeh keragaman fungsional ing komunitas mikroba individu sing sadurunge ora dilindhungi dening urutan genom referensi mikroorganisme (REFs) 14.Kemampuan kanggo nempatake macem-macem fungsi sing durung ditemokake ing konteks genom inang (yaiku, resolusi genom) penting banget kanggo prédhiksi garis mikroba sing durung ditepungi sing diduga ngode produk alami anyar15,16 utawa kanggo nglacak senyawa kasebut bali menyang produser asli17.Contone, pendekatan analisis genomik metagenomik lan siji-sel tunggal wis nyebabake identifikasi Candidatus Entotheonella, klompok bakteri sing digandhengake karo spons sing sugih metabolik, minangka produser saka macem-macem potensial obat18.Nanging, sanajan ana upaya anyar kanggo eksplorasi genomik komunitas mikroba sing maneka warna,16,19 luwih saka rong pertiga data metagenomik global kanggo ekosistem samudra paling gedhe ing bumi16,20 isih ilang.Mangkono, ing umum, potensial biosintetik saka microbiome segara lan potensial minangka repositori novel enzimatik lan produk alam isih akeh understudied.
Kanggo njelajah potensi biosintetik mikrobioma laut ing skala global, kita pisanan nglumpukake genom mikroba laut sing dipikolehi nggunakake metode sing gumantung karo budaya lan non-kultur kanggo nggawe database ekstensif filogenetik lan fungsi gen.Pamriksan database iki nuduhake macem-macem klompok gen biosintetik (BGC), sing paling akeh kalebu kulawarga kluster gen (GCF) sing durung dikarakterisasi.Kajaba iku, kita ngenali kulawarga bakteri sing ora dingerteni sing nuduhake keragaman BGC sing paling dhuwur ing segara mbukak nganti saiki.Kita milih loro jalur sintesis ribosom lan jalur peptida (RiPP) sing dimodifikasi pasca translasi kanggo validasi eksperimen adhedhasar beda genetis saka jalur sing saiki dikenal.Karakterisasi fungsional saka jalur kasebut wis ngungkapake conto enzimologi sing ora dikarepke uga senyawa struktural sing ora biasa kanthi aktivitas inhibisi protease.
Kaping pisanan, kita ngarahake nggawe sumber data global kanggo analisis genom, fokus ing komponen bakteri lan archaeal.Kanggo tujuan iki, kita nglumpukake data metagenomik lan 1038 conto banyu segara saka 215 situs sampling sing disebarake sacara global (rentang lintang = 141,6 °) lan sawetara lapisan jero (saka 1 nganti 5600 m ing ambane, nutupi zona pelagic, mesopelagic lan abyssal).Background21,22,23 (Gambar 1a, data lengkap, Gambar 1a lan Tabel Tambahan 1).Saliyane nyedhiyakake jangkoan geografis sing wiyar, conto sing disaring kanthi selektif iki ngidini kita mbandhingake macem-macem komponen mikrobioma segara, kalebu kaya virus (<0.2 µm), sugih prokariotik (0.2–3 µm), kaya partikel (0.8 µm). ).–20 µm) lan koloni virus-depleted (>0,2 µm).
a, Gunggunge 1038 génom sing kasedhiya kanggo umum (metagenomik) komunitas mikroba segara sing diklumpukake saka 215 lokasi sing disebarake sacara global (62°S nganti 79°U lan 179°W nganti 179°E.).Kothak peta © Esri.Sumber: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, lan Esri.b, metagenom iki digunakake kanggo rekonstruksi MAG (metode lan informasi tambahan), sing beda-beda ing jumlah lan kualitas (metode) ing dataset (ditandani ing werna).MAG sing direkonstruksi ditambah karo génom (eksternal) sing kasedhiya kanggo umum, kalebu MAG26, SAG27 lan REF buatan tangan.27 Nglumpukake OMD.c, dibandhingake karo laporan sadurunge mung adhedhasar SAG (GORG) 20 utawa MAG (GEM) 16, OMD nambah karakterisasi genom komunitas mikroba laut (tingkat pemetaan metagenomik diwaca; metode) kanthi loro nganti telu kanthi perwakilan sing luwih konsisten lan ambane. garis lintang..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD panglompokan menyang tingkat klompok spesies (95% tegese identitas nukleotida) ngenali total udakara udakara 8300 spesies, luwih saka setengah sing sadurunge durung ditondoi miturut anotasi taksonomi nggunakake GTDB (versi 89) e, klasifikasi spesies miturut jinis genom nuduhake yen MAG, SAG lan REF saling nglengkapi kanthi apik kanggo nggambarake keragaman filogenetik microbiome laut.Khususé, 55%, 26% lan 11% spesies kasebut spesifik kanggo MAG, SAG lan REF.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, génom saka microbiome bumi;GORG, génom referensi samudra global;HOT, seri wektu Samudra Hawaii.
Nggunakake dataset iki, kita mbangun total 26.293 MAG, biasane bakteri lan archaeal (Gambar 1b lan data sing ditambahi, Gambar 1b).Kita nggawe MAG iki saka majelis saka conto metagenomic kapisah tinimbang pooled kanggo nyegah ambruk variasi urutan alam antarane conto saka lokasi beda utawa titik wektu (metode).Kajaba iku, kita nglumpukake fragmen genomik adhedhasar korélasi prevalensi ing pirang-pirang conto (saka 58 nganti 610 conto, gumantung saka survey; metode).Kita nemokake manawa iki minangka langkah sing akeh wektu nanging penting 24 sing dilewati ing pirang-pirang karya rekonstruksi MAG16, 19, 25 skala gedhe lan nambah jumlah (rata-rata 2,7 kali lipat) lan kualitas (rata-rata + 20%) saka génom.direkonstruksi saka metagenome segara sinau kene (data lengkap, Fig. 2a lan informasi tambahan).Sakabèhé, upaya kasebut nyebabake kenaikan 4,5 kali lipat ing MAG mikroba laut (6 kali lipat yen mung MAG kualitas dhuwur sing dianggep) dibandhingake karo sumber MAG paling lengkap sing kasedhiya saiki16 (Metode).Set MAG sing mentas digawe iki banjur digabungake karo 830 MAG26, 5969 SAG27 lan 1707 REF.Rong puluh pitu spesies bakteri laut lan archaea nggawe koleksi gabungan saka 34.799 génom (Gambar 1b).
Kita banjur ngevaluasi sumber sing mentas digawe kanggo nambah kemampuan kanggo makili komunitas mikroba segara lan netepake dampak saka nggabungake macem-macem jinis genom.Rata-rata, kita nemokake manawa nyakup kira-kira 40-60% data metagenomik laut (Gambar 1c), loro nganti kaping telu jangkoan laporan mung MAG sadurunge ing ambane lan garis lintang More serial 16 utawa SAG20.Kajaba iku, kanggo ngukur keragaman taksonomi kanthi sistematis ing koleksi sing wis ditemtokake, kita menehi anotasi kabeh genom nggunakake toolkit (metode) Database Taksonomi Genom (GTDB) lan nggunakake identitas nukleotida rata-rata genom 95%.28 kanggo ngenali 8.304 kluster spesies (spesies).Rong pertiga saka spesies kasebut (kalebu clade anyar) sadurunge ora katon ing GTDB, sing 2790 ditemokake nggunakake MAG sing direkonstruksi ing panliten iki (Fig. 1d).Kajaba iku, kita nemokake manawa macem-macem jinis genom saling melengkapi: 55%, 26%, lan 11% spesies kabeh dumadi saka MAG, SAG, lan REF (Gambar 1e).Kajaba iku, MAG nutupi kabeh 49 jinis sing ditemokake ing kolom banyu, dene SAG lan REF mung makili 18 lan 11.Nanging, SAG luwih nggambarake keragaman saka klad sing paling umum (data sing ditambahi, Fig. 3a), kayata Pelagic Bacteriales (SAR11), kanthi SAG sing meh 1300 spesies lan MAG mung 390 spesies.Utamane, REF arang banget tumpang tindih karo MAG utawa SAG ing tingkat spesies lan diwakili> 95% saka kira-kira 1000 génom sing ora ditemokake ing set metagenomik samudra terbuka sing diteliti ing kene, utamane amarga interaksi karo jinis spesimen laut perwakilan sing terisolasi (contone, endapan). .utawa host-associate).Supaya kasedhiya kanggo komunitas ilmiah, sumber genom segara iki, sing uga kalebu fragmen sing ora diklasifikasikake (umpamane, saka fag sing diprediksi, pulo genomik, lan fragmen genom sing ora ana data sing cukup kanggo rekonstruksi MAG), bisa dibandhingake karo data taksonomi. .Akses anotasi bebarengan karo fungsi gen lan parameter kontekstual ing Database Mikrobiologi Samudra (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Kita banjur metu kanggo njelajah kasugihan lan anyar potensial biosintetik ing microbiome segara mbukak.Kanggo tujuan iki, pisanan nggunakake antiSMASH kanggo kabeh MAG, SAG, lan REF sing ditemokake ing 1038 metagenom (metode) laut kanggo prédhiksi total 39,055 BGC.Kita banjur nglumpukake iki dadi 6907 GCF sing ora keluwih lan 151 populasi kluster gen (GCCs; Tabel Tambahan 2 lan metode) kanggo nyathet redundansi bawaan (yaiku, BGC sing padha bisa dienkode ing pirang-pirang génom) lan data metagenomik Fragmentasi saka BGC sing konsentrasi.BGC sing ora lengkap ora mundhak sacara signifikan, yen ana (Informasi Tambahan), jumlah GCF lan GCC, masing-masing, ngemot paling ora siji anggota BGC sing utuh ing 44% lan 86% kasus.
Ing tingkat GCC, kita nemokake macem-macem RiPP sing diprediksi lan produk alami liyane (Gambar 2a).Antarane, contone, arilpolyene, karotenoid, ektoin, lan siderofor kalebu GCC kanthi distribusi filogenetik sing wiyar lan akeh banget ing metagenome samudra, sing bisa uga nuduhake adaptasi mikroorganisme sing akeh ing lingkungan segara, kalebu resistensi spesies oksigen reaktif, stres oksidatif lan osmotik..utawa panyerepan wesi (informasi liyane).Keragaman fungsional iki beda karo analisis anyar babagan 1.2 yuta BGC ing antarane kira-kira 190.000 genom sing disimpen ing basis data NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, sing sabanjure diarani RefSeq)29, sing nuduhake yen peptida Synthetase nonribosomal (NRPS) lan sintase poliketideden. (PKS) BGCs (Informasi Tambahan).Kita uga nemokake 44 (29%) GCC mung ana hubungane karo RefSeq BGC (\ (\ bar {d} \) RefSeq> 0.4; Fig. 2a lan metode) lan 53 (35%) GCC mung ing MAG, nyoroti potensial. kanggo ndeteksi bahan kimia sing durung diterangake sadurunge ing OMD.Amarga saben GCC iki bisa uga makili fungsi biosintetik sing maneka warna, kita luwih nganalisa data ing tingkat GCF minangka upaya kanggo nyedhiyakake klompok BGC sing luwih rinci sing diprediksi bakal menehi kode kanggo produk alami sing padha29.Gunggunge 3861 (56%) GCF sing diidentifikasi ora tumpang tindih karo RefSeq, lan> 97% GCF ora ana ing MIBiG, salah sawijining database paling gedhe saka BGC sing divalidasi kanthi eksperimen (Gambar 2b).Nalika ora nggumunake nemokake akeh jalur novel sing potensial ing setelan sing ora diwakili kanthi genom referensi, metode kita kanggo dereplicating BGCs menyang GCFs sadurunge benchmarking beda karo laporan sadurunge 16 lan ngidini kita menehi penilaian sing ora bias babagan anyar.Umume keragaman anyar (3012 GCF utawa 78%) cocog karo ramalan terpenes, RiPP utawa produk alami liyane, lan umume (1815 GCF utawa 47%) dikode ing jinis sing ora dingerteni amarga potensial biosintetik.Ora kaya kluster PKS lan NRPS, BGC kompak iki kurang bisa dipecah-pecah sajrone perakitan metagenomik 31 lan ngidini karakterisasi fungsional sing luwih akeh wektu lan sumber daya kanggo produke.
Gunggunge 39.055 BGC dikelompokake dadi 6.907 GCF lan 151 GCC.a, representasi data (eksternal internal).Klaster hirarkis jarak BGC adhedhasar GCC, 53 sing diatasi mung MAG.GCC ngandhut BGC saka taxa beda (frekuensi gerbang ln-transformed) lan kelas BGC beda (ukuran bunder cocog karo frekuensi).Kanggo saben GCC, lapisan njaba nggambarake jumlah BGC, prevalensi (persentase sampel), lan jarak (jarak kosinus BGC minimal (min(dMIBiG))) saka BiG-FAM nganti BGC.GCCs karo BGCs raket related kanggo eksperimen diverifikasi BGCs (MIBiG) disorot karo panah.b Mbandingaken GCF karo prediksi (BiG-FAM) lan eksperimen divalidasi (MIBiG) BGCs, 3861 anyar (d-> 0,2) GCFs ditemokake.Umume (78%) kode kasebut kanggo RiPP, terpenes, lan produk alami liyane.c, kabeh génom ing OMD ditemokake ing 1038 metagenom segara diselehake ing wit dhasar GTDB kanggo nuduhake jangkoan filogenetik saka OMD.Clades tanpa génom ing OMD ditampilake ing werna abu-abu.Jumlah BGC cocog karo jumlah BGC paling gedhe sing diprediksi saben genom ing klade tartamtu.Kanggo gamblang, 15% pungkasan saka simpul ambruk.Panah nuduhake clade sing sugih ing BGC (> 15 BGC), kajaba Mycobacterium, Gordonia (kalorone mung Rhodococcus), lan Crocosphaera (kalorone mung Synechococcus).d, ora dingerteni c.Eremiobacterota nuduhake keragaman biosintetik paling dhuwur (indeks Shannon adhedhasar jinis produk alami).Saben pita makili génom sing paling akèh BGC ing spesies kasebut.T1PKS, PKS tipe I, T2/3PKS, PKS tipe II lan tipe III.
Saliyane kasugihan lan kebaruan, kita njelajah struktur biogeografik potensi biosintetik mikrobioma laut.Panglompokan conto miturut distribusi nomer salinan GCF metagenomik rata-rata (Metode) nuduhake manawa komunitas sing sugih ing lintang rendah, permukaan, prokariotik lan miskin virus, biasane saka permukaan utawa banyu sing luwih jero, sugih ing terpenes RiPP lan BGC.Ing kontras, kutub, segara jero, virus- lan komunitas sing sugih partikel digandhengake karo kelimpahan NRPS lan PKS BGC sing luwih dhuwur (data sing ditambahi, Fig. 4 lan informasi tambahan).Pungkasan, kita nemokake manawa komunitas tropis lan pelagik sing ditliti kanthi apik minangka sumber terpenes anyar sing paling njanjeni (Gambar Data Tambahan).Potensi paling dhuwur kanggo PKS, RiPP lan produk alami liyane (Gambar 5a kanthi data sing ditambahi).
Kanggo nglengkapi sinau babagan potensi biosintetik mikrobioma laut, kita ngarahake peta distribusi filogenetik lan ngenali klad sing diperkaya BGC anyar.Kanggo tujuan iki, kita nyelehake génom mikroba segara menyang wit filogenetik bakteri lan archaeal GTDB13 sing dinormalisasi lan nutupi jalur biosintetik putative sing dikodekan (Fig. 2c).Kita wis gampang ndeteksi sawetara clades sing diperkaya BGC (diwakili luwih saka 15 BGC) ing conto banyu segara (metode) sing dikenal kanthi potensial biosintetik, kayata cyanobacteria (Synechococcus) lan bakteri Proteus, kayata Tistrella32,33, utawa sing lagi wae narik perhatian amarga produk alami.kayata Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus lan Planctomycetota34,35,36.Sing nggumunake, kita nemokake sawetara garis keturunan sing durung ditelusuri ing klad kasebut.Contone, spesies kasebut kanthi potensial biosintetik paling sugih ing filum Planctomycetota lan Myxococcota kalebu pesenan lan genera calon sing ora ditemtokake (Tabel Tambahan 3).Digabungake, iki nuduhake yen OMD menehi akses menyang informasi filogenetik sing durung dingerteni sadurunge, kalebu mikroorganisme, sing bisa makili target anyar kanggo panemuan enzim lan produk alami.
Sabanjure, kita menehi ciri klade sing diperkaya BGC kanthi ora mung ngetung jumlah maksimum BGC sing dikode dening anggotane, nanging uga ngevaluasi keragaman BGC kasebut, sing nerangake frekuensi macem-macem jinis produk calon alami (Gambar 2c lan metode). )..Kita nemokake manawa spesies sing paling macem-macem biosintetik diwakili dening MAG bakteri sing direkayasa khusus ing panliten iki.Bakteri iki kalebu filum Candidatus Eremiobacterota sing ora dibudidayakake, sing isih akeh sing durung ditliti kajaba sawetara studi genomik37,38.Wigati dicathet yen "ca.Genus Eremiobacterota mung dianalisis ing lingkungan terrestrial39 lan ora dikawruhi kalebu anggota sing dikaya ing BGC.Ing kene kita wis mbangun maneh wolung MAG saka spesies sing padha (identitas nukleotida> 99%) 23. Mulane kita ngusulake jeneng spesies "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii", dijenengi sawise nereid (nymph segara), hadiah sing apik ing mitologi Yunani lan ekspedisi.'Ka.Miturut anotasi phylogenetic 13, E. malaspinii ora duwe sanak keluarga sadurunge ing ngisor tingkat urutan lan kanthi mangkono kalebu kulawarga bakteri anyar sing diusulake "Ca.E. malaspinii" minangka spesies jinis lan "Ca.Eudormicrobiaceae" minangka jeneng resmi (Informasi Tambahan).Rekonstruksi metagenomik singkat saka 'Ca.Proyèk genom E. malaspinii divalidasi dening input banget kurang, long maca urutan metagenomic lan diangkah perakitan sampel siji (Metode) minangka siji 9,63 Mb kromosom linear karo duplikasi 75 kb.minangka siji-sijine ambiguitas sing isih ana.
Kanggo netepake konteks filogenetik spesies iki, kita nggoleki 40 spesies sing raket banget ing conto metagenomik sing diperkaya eukariotik tambahan saka ekspedisi Samudra Tara liwat rekonstruksi genom sing ditarget.Sedhela, kita wis nyambungake maca metagenomik menyang fragmen genom sing ana gandhengane karo "Ca.E. malaspinii" lan hipotesis yen tingkat rekrutmen sing tambah ing sampel iki nuduhake anané sanak-sedulur liyane (metode).Akibaté, kita nemokake 10 MAG, kombinasi 19 MAG sing makili limang spesies ing telung genera ing kulawarga sing mentas ditetepake (ie "Ca. Eudormicrobiaceae").Sawise pengawasan manual lan kontrol kualitas (data ditambahi, Fig. 6 lan informasi tambahan), kita ketemu sing "Ca.Spesies Eudormicrobiaceae nampilake genom sing luwih gedhe (8 Mb) lan potensial biosintetik sing luwih sugih (14 nganti 22 BGC saben spesies) tinimbang anggota "Ca" liyane.Clade Eremiobacterota (nganti 7 BGC) (Fig. 3a-c).
a, Posisi filogenetik saka limang 'Ca.Spesies Eudormicrobiaceae nuduhake kasugihan BGC khusus kanggo garis laut sing diidentifikasi ing panliten iki.Wit filogenetik kalebu kabeh 'Ca.MAG Eremiobacterota lan anggota filum liyane (nomer genom ing kurung) sing kasedhiya ing GTDB (versi 89) digunakake kanggo latar mburi evolusi (Metode).Lapisan paling njaba nggambarake klasifikasi ing tingkat kulawarga ("Ca. Eudormicrobiaceae" lan "Ca. Xenobiaceae") lan ing tingkat kelas ("Ca. Eremiobacteria").Lima spesies sing diterangake ing panliten iki diwakili dening kode alfanumerik lan jeneng binomial sing diusulake (Informasi Tambahan).b ,ok.Spesies Eudormicrobiaceae nuduhake pitung inti BGC sing umum.Ora ana BGC ing klad A2 amarga ora lengkap perwakilan MAG (Tabel Tambahan 3).BGCs khusus kanggo "Ca.Amphithomicrobium" lan "Ca.Amphithomicrobium" (klade A lan B) ora ditampilake.c, Kabeh BGCs dienkode minangka "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii ditemokake ing 623 metatranscriptomes dijupuk saka segara Tara.Lingkaran padhet nuduhake transkripsi aktif.Lingkaran oranye nuduhake owah-owahan lipatan sing diowahi log2 ing ngisor lan ndhuwur tingkat ekspresi gene housekeeping (metode).d, kurva kelimpahan relatif (metode) nuduhake 'Ca.Spesies Eudormicrobiaceae kasebar ing akèh-akèhé cekungan segara lan ing kabèh kolom banyu (saka lumahing nganti ambane paling sethithik 4000 m).Adhedhasar prakiraan kasebut, kita nemokake manawa 'Ca.E. malaspinii 'nyusun nganti 6% sel prokariotik ing komunitas sing ana gandhengane karo gandum pelagis segara.Kita dianggep minangka spesies sing ana ing sawijining situs yen ditemokake ing bagean cilik saka ukuran lapisan ambane tartamtu.IO - Samudra Hindia, NAO - Atlantik Lor, NPO - Pasifik Lor, RS - Laut Merah, SAO - Atlantik Kidul, SO - Samudra Kidul, SPO - Pasifik Kidul.
Sinau kelimpahan lan distribusi Ca.Eudormicrobiaceae, sing, kaya sing kita temokake, dominan ing akeh cekungan segara, uga ing kabeh kolom banyu (Gambar 3d).Sacara lokal, 6% saka komunitas mikroba laut, dadi bagean penting saka mikrobioma laut global.Kajaba iku, kita nemokake isi relatif Ca.Spesies Eudormicrobiaceae lan tingkat ekspresi BGC paling dhuwur ing fraksi sing diperkaya eukariotik (Gambar 3c lan data lengkap, Gambar 7), nuduhake kemungkinan interaksi karo partikel, kalebu plankton.Pengamatan iki meh padha karo 'Ca.Eudoremicrobium BGCs sing ngasilake produk alami sitotoksik liwat jalur sing dikenal bisa nuduhake prilaku predator (Informasi Tambahan lan Data Expanded, Gambar 8), padha karo predator liyane sing khusus ngasilake metabolit kayata Myxococcus41.Penemuan Ca.Eudormicrobiaceae ing sampel sing kurang kasedhiya (samudra jero) utawa eukariotik tinimbang prokariotik bisa nerangake sebabe bakteri kasebut lan keragaman BGC sing ora dikarepake tetep ora jelas ing konteks riset panganan alami.
Pungkasane, kita ngupayakake eksperimen kanggo validasi janji kerja adhedhasar mikrobioma kanggo nemokake jalur anyar, enzim, lan produk alami.Ing antarane kelas BGC sing beda-beda, jalur RiPP dikenal kanggo ngodeake keragaman kimia lan fungsional sing sugih amarga macem-macem modifikasi pasca-translasi saka peptida inti dening enzim diwasa42.Dadi kita milih loro 'Ca.Eudoremicrobium 'RiPP BGCs (Gambar 3b lan 4a-e) adhedhasar padha karo sembarang BGC dikenal (\(\bar{d}\)MIBiG lan \(\bar{d}\)RefSeq ndhuwur 0.2).
a-c, Ekspresi heterolog in vitro lan tes enzimatik in vitro saka novel (\ (\ bar {d} \) RefSeq = 0.29) kluster biosintesis RiPP khusus kanggo spesies Ca segara jero.E. malaspinii' mimpin kanggo produksi produk diphosphorylated.c, modifikasi sing diidentifikasi nggunakake resolusi dhuwur (HR) MS / MS (fragmentasi sing dituduhake dening ion b lan y ing struktur kimia) lan NMR (data sing ditambahi, Fig. 9).d, peptida fosforilasi iki nuduhake inhibisi micromolar kurang saka elastase neutrofil mamalia, sing ora ditemokake ing peptida kontrol lan peptida dehidrasi (dehidrasi sing disebabake dening penghapusan kimia).Eksperimen kasebut diulang kaping telu kanthi asil sing padha.Contone, ekspresi heterolog saka novel kapindho \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) klompok biosintesis protein njlentrehake fungsi saka papat enzim diwasa sing ngowahi 46 peptida inti asam amino.Sisa diwarnai miturut situs modifikasi sing diprediksi dening HR-MS / MS, label isotop, lan analisis NMR (Informasi Tambahan).Werna garis-garis nuduhake yen modifikasi ana ing salah siji saka rong residu kasebut.Angka kasebut minangka kompilasi saka pirang-pirang konstruksi heterolog kanggo nuduhake aktivitas kabeh enzim diwasa ing inti sing padha.h, Ilustrasi data NMR kanggo backbone amida N-methylation.Hasil lengkap ditampilake ing anjir.10 kanthi data lengkap.i, Posisi filogenetik saka enzim klompok protein FkbM sing diwasa ing antarane kabeh domain FkbM sing ditemokake ing database MIBiG 2.0 nuduhake enzim saka kulawarga iki kanthi aktivitas N-methyltransferase (Informasi Tambahan).Diagram skematis BGCs (a, e), struktur peptida prekursor (b, f), lan struktur kimia putatif produk alami (c, g) ditampilake.
Jalur RiPP pisanan (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) mung ditemokake ing spesies segara jero "Ca.E. malaspinii "lan kode kanggo Peptide- prekursor (Fig. 4a, b).Ing enzim diwasa iki, kita wis ngidentifikasi domain fungsional siji homolog karo domain dehidrasi lantipeptide synthase sing biasane catalyzes fosforilasi lan penghapusan sakteruse saka 43 (Informasi Tambahan).Mula, kita prédhiksi manawa modifikasi peptida prekursor kalebu dehidrasi rong langkah.Nanging, nggunakake spektrometri massa tandem (MS / MS) lan spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR), kita nemtokake peptida linier polifosforilasi (Gambar 4c).Sanajan ora dikarepke, kita nemokake sawetara bukti kanggo ndhukung produk pungkasan: rong host heterolog sing beda lan ora ana dehidrasi ing tes in vitro, identifikasi residu kunci sing dimutasi ing situs dehidrasi katalitik enzim diwasa.kabeh direkonstruksi dening "Ca".Genom E. malaspinii (data sing ditambahi, Gambar 9 lan informasi tambahan) lan, pungkasane, aktivitas biologis saka prodhuk fosforilasi, nanging ora wangun dehidrasi sing disintesis sacara kimia (Gambar 4d).Nyatane, kita nemokake yen nuduhake aktivitas inhibisi protease mikromolar sing kurang marang elastase neutrofil, sing bisa dibandhingake karo produk alam liyane sing gegandhengan ing kisaran konsentrasi (IC50 = 14.3 μM) 44, sanajan peran ekologis tetep dijlentrehake.Adhedhasar asil kasebut, kita ngusulake jeneng jalur kasebut "phospheptin".
Kasus kapindho yaiku jalur RiPP kompleks khusus kanggo 'Ca.Genus Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) diprediksi bisa encode produk protein alami (Fig. 4e).Jalur kasebut minangka kapentingan bioteknologi tartamtu amarga kapadhetan sing dikarepake lan macem-macem modifikasi kimia sing ora biasa sing ditetepake dening enzim sing dikode dening BGCs45 sing relatif cendhak.Kita nemokake manawa protein iki beda karo protèin sing wis ditondoi sadurungé amarga ora duwé motif NX5N utama saka polyceramides lan loop lanthionine saka landornamides 46 .Kanggo ngatasi watesan pola ekspresi heterolog sing umum, kita digunakake bebarengan karo sistem Microvirgula aerodenitrificans khusus kanggo ciri papat enzim pathway diwasa (metode).Nggunakake kombinasi MS / MS, labeling isotop, lan NMR, kita ndeteksi enzim diwasa kasebut ing inti asam 46-amino saka peptida (Fig. 4f, g, data sing ditambahi, Fig. 10-12 lan informasi tambahan).Antarane enzim diwasa, kita ditondoi pisanan saka anggota kulawarga FkbM O-methyltransferase 47 ing jalur RiPP lan ora dikarepke nemokake yen enzim diwasa iki ngenalake backbone N-methylation (Fig. 4h, i lan informasi tambahan).Sanajan modifikasi iki dikenal ing produk NRP48 alami, N-metilasi enzimatik ikatan amida minangka reaksi kompleks nanging bioteknologis signifikan49 sing nganti saiki wis dadi kapentingan kanggo kulawarga borosin RiPP.Kekhususan 50,51.Identifikasi aktivitas iki ing kulawarga enzim lan RiPP liyane bisa mbukak aplikasi anyar lan ngembangake keragaman fungsional protein 52 lan keragaman kimia.Adhedhasar modifikasi sing diidentifikasi lan dawa ora biasa saka struktur produk sing diusulake, kita ngusulake jeneng jalur "pythonamide".
Panemuan enzimologi sing ora dikarepke ing kulawarga enzim sing nduweni ciri fungsional nggambarake janji genomik lingkungan kanggo panemuan anyar, lan uga nggambarake kapasitas winates kanggo inferensi fungsional adhedhasar homologi urutan wae.Mangkono, bebarengan karo laporan RiPP polifosforilasi bioaktif non-kanonik, asil kita nuduhake nilai intensif sumber daya nanging kritis kanggo upaya biologi sintetik kanggo nemokake kasugihan fungsional, keragaman, lan struktur senyawa biokimia sing ora biasa.
Ing kene kita nduduhake macem-macem potensial biosintetik sing dikode dening mikroba lan konteks genomik ing mikrobioma laut global, nggampangake riset ing mangsa ngarep kanthi nyedhiyakake sumber daya sing kasedhiya kanggo komunitas ilmiah (https://microbiomics.io/ocean/).Kita nemokake manawa akeh filogenetik lan fungsional anyar mung bisa dipikolehi kanthi rekonstruksi MAG lan SAG, utamane ing komunitas mikroba sing ora digunakake sing bisa nuntun upaya bioprospecting ing mangsa ngarep.Senajan kita bakal fokus ing kene 'Ca.Eudormicrobiaceae" minangka garis keturunan utamane biosintetik "berbakat", akeh BGC sing diprediksi ing mikrobiota sing durung ditemokake bisa nyandi enzim sing durung diterangake sadurunge sing ngasilake senyawa kanthi tumindak sing penting kanggo lingkungan lan / utawa bioteknologi.
Dataset metagenomik saka studi oseanografi lan seri wektu utama kanthi kedalaman urutan sing cukup dilebokake kanggo nggedhekake jangkoan komunitas mikroba laut global ing cekungan segara, lapisan jero lan liwat wektu.Dataset kasebut (Tabel Tambahan 1 lan Gambar 1) kalebu metagenomik saka conto sing diklumpukake ing segara Tara (dikaya virus, n = 190; prokariotik diperkaya, n = 180) 12,22 lan ekspedisi BioGEOTRACES (n = 480).Hawaiian Oceanic Time Series (HOT, n = 68), Bermuda-Atlantic Time Series (BATS, n = 62)21 lan Ekspedisi Malaspina (n = 58)23.Wacan urutan saka kabeh pecahan metagenomik disaring kanggo kualitas nggunakake BBMap (v.38.71) kanthi mbusak adaptor urutan saka maca, mbusak wacan sing dipetakan menyang urutan kontrol kualitas (genom PhiX), lan nggunakake trimq = 14, maq = 20 mbuwang kualitas maca sing ora apik, maxns = 0 lan minlength = 45. Analisis sakteruse padha mbukak utawa digabungake karo QC maca yen kasebut (bbmerge.sh minoverlap = 16).Wacan QC dinormalisasi (target bbnorm.sh = 40, minddepth = 0) sadurunge dibangun nggunakake metaSPAdes (v.3.11.1 utawa v.3.12 yen perlu)53.Contigs scaffold sing diasilake (sabanjure diarani scaffolds) pungkasane disaring kanthi dawa (≥1 kb).
Sampel metagenomik 1038 dipérang dadi klompok, lan kanggo saben klompok sampel, kontrol kualitas metagenomik diwaca kabeh conto dicocogake karo kurung saben sampel kanthi kapisah, nyebabake nomer klompok sing dikurung pasangan kasebut: Tara Marine Virus - Enriched (190×190), Prokariota Enriched (180×180), BioGEOTRACES, HOT lan BAT (610×610) lan Malaspina (58×58).Pemetaan ditindakake kanthi nggunakake Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188) 54 sing ngidini maca bisa cocog karo situs sekunder (nggunakake -a flag).Alignments disaring dadi paling sethithik 45 basa dawa, duwe ≥97% identitas, lan span ≥80% maca.File BAM asil diproses nggunakake script jgi_summarize_bam_contig_depths kanggo MetaBAT2 (v.2.12.1)55 kanggo menehi jangkoan intra lan antar sampel kanggo saben klompok.Akhire, kurung padha diklompokaké kanggo nambah sensitivitas dening individu mbukak MetaBAT2 ing kabeh conto karo -minContig 2000 lan -maxEdges 500. Kita nggunakake MetaBAT2 tinimbang boxer ensemble amarga wis ditampilake ing tes independen minangka petinju tunggal sing paling efektif.lan 10 nganti 50 kaping luwih cepet tinimbang petinju liyane sing umum digunakake57.Kanggo nguji efek korélasi kelimpahan, subsample metagenomik sing dipilih kanthi acak (10 kanggo saben rong set data Samudra Tara, 10 kanggo BioGEOTRACES, 5 kanggo saben seri wektu, lan 5 kanggo Malaspina) mung nggunakake conto.Sampel internal diklompokaké kanggo njupuk informasi jangkoan.(Informasi Tambahan).
Genom tambahan (eksternal) kalebu ing analisis sakteruse, yaiku 830 MAG sing dipilih kanthi manual saka subset saka dataset Tara Oceans26, 5287 SAG saka dataset GORG20, lan data saka database MAR (MarDB v. 4) saka 1707 REF terisolasi lan 682 SAGs) 27. Kanggo dataset MarDB, genom dipilih adhedhasar metadata sing kasedhiya yen jinis sampel cocog karo ekspresi reguler ing ngisor iki: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] diisolasi'.
Kualitas saben wadhah metagenomik lan genom eksternal ditaksir nggunakake CheckM (v.1.0.13) lan Alur Kerja Lineage Anvi'o (v.5.5.0)58,59.Yen CheckM utawa Anvi'o nglaporake ≥50% kelengkapan/kelengkapan lan ≤10% kontaminasi/redundansi, banjur simpen sel metagenomik lan genom eksternal kanggo analisis mengko.Skor kasebut banjur digabung dadi rata-rata ketuntasan (mcpl) lan rata-rata kontaminasi (mctn) kanggo nggolongake kualitas genom miturut kriteria komunitas60 kaya ing ngisor iki: kualitas dhuwur: mcpl ≥ 90% lan mctn ≤ 5%;kualitas apik: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, kualitas medium: mcpl ≥ 50% lan mctn ≤ 10%, kualitas adil: mcpl ≤ 90% utawa mctn ≥ 10%.Genom sing disaring banjur digandhengake karo skor kualitas (Q lan Q') kaya ing ngisor iki: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (variabilitas galur)/100 + 0,5 x log[N50].(dilaksanakake ing dRep61).
Kanggo ngidini analisis komparatif antarane macem-macem sumber data lan jinis genom (MAG, SAG lan REF), 34.799 genom didereferensi adhedhasar identitas nukleotida rata-rata genom (ANI) nggunakake dRep (v.2.5.4).Baleni)61 ​​kanthi ambang 95% ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) lan gen panandha salinan tunggal nggunakake SpecI63 nyedhiyakake kluster genom ing tingkat spesies.Genom perwakilan dipilih kanggo saben kluster dRep miturut skor kualitas maksimum (Q') sing ditemtokake ing ndhuwur, sing dianggep minangka wakil saka spesies kasebut.
Kanggo ngevaluasi kacepetan pemetaan, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) digunakake kanggo peta kabeh 1038 set maca metagenomik kanthi 34.799 génom sing ana ing OMD.Wacan sing dikontrol kualitas dipetakan ing mode siji-rampung lan alignment sing diasilake disaring kanggo nahan alignment mung ≥45 bp.lan identitas ≥95%.Rasio tampilan kanggo saben sampel yaiku persentase bacaan sing isih ana sawise filtrasi dibagi karo jumlah total maca kontrol kualitas.Nggunakake pendekatan sing padha, saben 1038 metagenom dikurangi dadi 5 yuta sisipan (data sing ditambahi, Gambar 1c) lan cocog karo GORG SAG ing OMD lan ing kabeh GEM16.Jumlah MAG sing mbalekake saka banyu segara ing katalog GEM16 ditemtokake dening pitakon kunci sumber metagenomik, milih conto banyu segara (contone, minangka lawan saka endapan segara).Secara khusus, kita milih "akuatik" minangka "kategori_ekosistem", "laut" minangka "tipe_ekosistem", lan nyaring "habitat" minangka "samudra jero", "laut", "samudra maritim", "laut pelagis", "banyu segara" , "Banyu Laut", "Banyu Laut", "Banyu Laut Permukaan", "Banyu Laut Permukaan".Iki ngasilaken ing 5903 MAG (734 kualitas dhuwur) mbagekke liwat 1823 OTUs (views kene).
Genom prokariotik dianotasi sacara taksonomi nggunakake GTDB-Tk (v.1.0.2)64 kanthi paramèter standar sing ditargetake GTDB r89 versi 13. Anvi'o digunakake kanggo ngenali genom eukariotik adhedhasar prediksi domain lan recall ≥50% lan redundansi ≤ 10%.Anotasi taksonomi spesies ditetepake minangka salah sawijining genom perwakilan.Kajaba saka eukariota (148 MAG), saben genom pisanan dianotasi kanthi fungsional nggunakake prokka (v.1.14.5)65, menehi jeneng gen lengkap, nemtokake parameter "archaea" utawa "bakteri" yen perlu, sing uga dilapurake kanggo non- coding gen.lan wilayah CRISPR, ing antarane fitur genom liyane.Anotasi gen sing diprediksi kanthi ngenali gen panandha salinan universal universal (uscMG) nggunakake fetchMG (v.1.2)66, nemtokake klompok ortholog lan pitakon nggunakake emapper (v.2.0.1)67 adhedhasar eggNOG (v.5.0)68.Basis data KEGG (diterbitake 10 Februari 2020) 69. Langkah pungkasan ditindakake kanthi cocog protein karo basis data KEGG nggunakake DIAMOND (v.0.9.30)70 kanthi pitakon lan jangkoan topik ≥70%.Asil luwih disaring miturut NCBI Prokariotik Genome Annotation Pipeline71 adhedhasar bitrate ≥ 50% saka maksimum sing dikarepake bitrate (link dhewe).Urutan gen uga digunakake minangka input kanggo ngenali BGC ing genom nggunakake antiSMASH (v.5.1.0)72 kanthi paramèter standar lan bledosan kluster sing beda.Kabeh génom lan anotasi wis dikompilasi menyang OMD bebarengan karo metadata kontekstual sing kasedhiya ing web (https://microbiomics.io/ocean/).
Padha karo metode sing wis diterangake sadurunge12,22 kita nggunakake CD-HIT (v.4.8.1) kanggo kluster> 56.6 yuta gen pengkode protein saka genom bakteri lan archaeal saka OMD dadi 95% identitas lan gen sing luwih cendhek (90% jangkoan)73 nganti > 17,7 yuta klompok gen.Urutan paling dawa dipilih minangka gen perwakilan kanggo saben kluster gen.Metagenom 1038 banjur dicocogake karo anggota kluster> 17.7 yuta BWA (-a) lan file BAM sing diasilake disaring kanggo nahan keselarasan kanthi identitas ≥95% lan ≥45 keselarasan basa.Kelimpahan gen sing dinormalisasi dawa diwilang kanthi ngetung sisipan pisanan saka keselarasan unik sing paling apik, banjur, kanggo sisipan sing dipetakan kabur, nambahake jumlah pecahan menyang gen target sing cocog karo jumlah sisipan unik.
Genom saka OMD ditambahi (karo MAG tambahan saka "Ca. Eudormicrobiaceae", ndeleng ngisor) ditambahake menyang mOTUs74 metagenomic analisis database alat (v.2.5.1) kanggo nggawe database referensi mOTU lengkap.Mung enem salinan siji-genom (23.528 génom) slamet saka sepuluh uscMGs.Ekspansi basis data ngasilake 4.494 kluster tambahan ing tingkat spesies.1038 metagenom dianalisis nggunakake paramèter mOTU standar (v.2).Gunggunge 989 génom sing ana ing 644 kluster mOTU (95% REF, 5% SAG lan 99.9% saka MarDB) ora dideteksi dening profil mOTU.Iki nggambarake macem-macem sumber tambahan isolasi segara saka génom MarDB (sebagéyan gedhé génom sing ora dideteksi digandhengake karo organisme sing diisolasi saka endapan, inang laut, lsp.).Kanggo terus fokus ing lingkungan segara mbukak ing panliten iki, kita ora kalebu saka analisis hilir kajaba padha dideteksi utawa kalebu ing database mOTU lengkap sing digawe ing panliten iki.
Kabeh BGC saka MAG, SAG lan REF ing OMD (ndeleng ndhuwur) digabungake karo BGC sing diidentifikasi ing kabeh scaffolds metagenomic (antiSMASH v.5.0, parameter standar) lan ditondoi nggunakake BiG-SLICE (v.1.1) (domain PFAM) 75.Adhedhasar fitur-fitur kasebut, kita ngetung kabeh jarak kosinus antarane BGC lan diklompokaké (tegese pranala) menyang GCF lan GCC kanthi nggunakake ambang jarak 0,2 lan 0,8.Ambang kasebut minangka adaptasi saka ambang sing sadurunge digunakake nggunakake Euclidean distance75 bebarengan karo jarak kosinus, sing nyuda sawetara kesalahan ing strategi clustering BiG-SLICE asli (Informasi Tambahan).
BGC banjur disaring kanggo nahan mung ≥5 kb sing dienkode ing scaffolds kanggo ngurangi risiko fragmentasi kaya sing diterangake sadurunge16 lan kanggo ngilangi REF lan SAG MarDB sing ora ditemokake ing 1038 metagenom (ndeleng ndhuwur).Iki nyebabake total 39.055 BGC sing dikode dening génom OMD, kanthi tambahan 14.106 sing diidentifikasi ing fragmen metagenomik (yaiku ora digabung dadi MAG).BGCs "metagenomik" iki digunakake kanggo ngira proporsi potensial biosintesis mikrobioma laut sing ora dijupuk ing basis data (Informasi Tambahan).Saben BGC ditondoi kanthi fungsional miturut jinis produk prediktif sing ditemtokake dening kategori produk anti-SMASH utawa luwih kasar sing ditetepake ing BiG-SCAPE76.Kanggo nyegah bias sampling ing kuantifikasi (komposisi taksonomi lan fungsional GCC/GCF, jarak GCF lan GCC menyang basis data referensi, lan kelimpahan metagenomik GCF), kanthi tetep mung BGC paling dawa saben GCF kanggo saben spesies, 39.055 BGC dikurangi maneh, ing asil ing total 17.689 BGC.
Kebaruan GCC lan GCF ditaksir adhedhasar jarak antarane database sing diwilang (database RefSeq ing BiG-FAM)29 lan sing diverifikasi sacara eksperimen (MIBIG 2.0) 30 BGC.Kanggo saben 17.689 wakil BGC, kita milih jarak kosinus paling cilik menyang basis data.Jarak minimal iki banjur dirata-rata (rata-rata) miturut GCF utawa GCC, sing cocog.A GCF dianggep anyar yen kadohan kanggo database luwih saka 0,2, kang cocog karo pamisahan becik antarane (rata-rata) GCF lan referensi.Kanggo GCC, kita milih 0.4, sing kaping pindho batesan sing ditetepake dening GCF, kanggo ngunci hubungan jangka panjang karo tautan.
Kelimpahan metagenomik BGC dikira minangka kelimpahan rata-rata gen biosintetik (kaya sing ditemtokake dening anti-SMASH) sing kasedhiya saka profil tingkat gen.Kelimpahan metagenomik saben GCF utawa GCC banjur diitung minangka jumlah BGC sing perwakilan (saka 17,689).Peta kelimpahan iki banjur dinormalisasi kanggo komposisi seluler nggunakake jumlah mOTU saben sampel, sing uga nyatakake upaya urutan (data sing ditambahi, Fig. 1d).Prevalensi GCF utawa GCC diitung minangka persentase sampel kanthi kelimpahan> 0.
Jarak Euclidean antarane conto diitung saka profil GCF sing dinormalisasi.Jarak kasebut dikurangi kanthi nggunakake UMAP77 lan asil embeddings digunakake kanggo clustering adhedhasar Kapadhetan tanpa pengawasan nggunakake HDBSCAN78.Jumlah titik minimal optimal kanggo kluster (lan mula jumlah kluster) sing digunakake dening HDBSCAN ditemtokake kanthi maksimalake kemungkinan kumulatif anggota kluster.Kluster sing diidentifikasi (lan subsample imbang acak saka kluster kasebut kanggo nyathet bias ing analisis multivariat permutasi varians (PERMANOVA)) dites kanggo pinunjul marang jarak Euclidean sing ora dikurangi nggunakake PERMANOVA.Ukuran genom rata-rata saka sampel diitung adhedhasar kelimpahan relatif mOTU lan perkiraan ukuran genom saka anggota genom.Utamane, ukuran genom rata-rata saben mOTU dikira minangka rata-rata ukuran genom anggotane sing dikoreksi kanggo kelengkapan (sawise nyaring) (contone, genom lengkap 75% kanthi dawane 3 Mb duwe ukuran sing disetel 4. Mb).kanggo genom medium kanthi integritas ≥70%.Ukuran genom rata-rata kanggo saben sampel banjur diitung minangka jumlah ukuran genom mOTU sing ditimbang kanthi kelimpahan relatif.
Sawijining set BGC sing dienkode genom ing OMD ditampilake ing wit GTDB bakteri lan archaeal (ing kerangka ≥5 kb, ora kalebu REF lan SAG MarDB sing ora ditemokake ing 1038 metagenom, deleng ing ndhuwur) lan kategori produk sing diprediksi adhedhasar filogenetik. posisi génom (ndeleng ndhuwur).Kita pisanan nyuda data miturut spesies, nggunakake genom kanthi BGC paling akeh ing spesies kasebut minangka wakil.Kanggo visualisasi, wakil kasebut dipérang dadi klompok wit, lan maneh, kanggo saben clade sel, genom sing ngemot jumlah BGC paling akeh dipilih minangka wakil.Spesies sing diperkaya BGC (paling ora siji génom kanthi> 15 BGC) dianalisis luwih lanjut kanthi ngitung Indeks Keanekaragaman Shannon kanggo jinis produk sing dikode ing BGC kasebut.Yen kabeh jinis produk sing diprediksi padha, hibrida kimia lan BGC kompleks liyane (kaya sing diprediksi dening anti-SMAH) dianggep kalebu jinis produk sing padha, ora preduli saka urutane ing klompok kasebut (contone, protein-bacteriocin lan bacteriocin-proteoprotein fusion. badan).hibrida).
Sisa DNA (kira-kira 6 ng) saka sampel Malaspina MP1648, cocog karo sampel biologi SAMN05421555 lan cocog karo Illumina SRR3962772 metagenomic read set kanggo maca cekak, diproses miturut protokol urutan PacBio kanthi input ultra-rendah kanggo nggunakake sampel PacBio kit SMRTlification gDNA kit (100-980-000) lan SMRTbell Express 2.0 kit preparation Cithakan (100-938-900).Sedhela, sisa DNA dipotong, didandani lan diresiki (manik ProNex) nggunakake Covaris (g-TUBE, 52104).DNA sing diresiki banjur disiapake perpustakaan, amplifikasi, pemurnian (manik-manik ProNex) lan pilihan ukuran (> 6 kb, Pippin Biru) sadurunge langkah pemurnian pungkasan (manik-manik ProNex) lan urutan ing platform Sekuel II.
Reconstruction saka loro pisanan ca.Kanggo MAG Eremiobacterota, kita nemtokake enem ANI tambahan> 99% (iki kalebu ing Figure 3), sing pisanan disaring adhedhasar skor kontaminasi (mengko diidentifikasi minangka duplikasi gen, deleng ing ngisor iki).Kita uga nemokake tray kanthi label "Ca".Eremiobacterota" saka macem-macem pasinaon23 lan digunakake bebarengan karo wolung MAG saka sinau kita minangka referensi kanggo maca metagenomic saka 633 eukariotik enriched (> 0.8 µm) conto nggunakake BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - flag) kanggo downsampled pemetaan (5 yuta diwaca).Adhedhasar peta khusus pengayaan (disaring kanthi identitas keselarasan 95% lan jangkoan maca 80%), metagenom 10 (jangkoan samesthine ≥5 ×) dipilih kanggo perakitan lan metagenom tambahan 49 (jangkoan samesthine ≥1 ×) kanggo korelasi isi.Nggunakake paramèter sing padha ing ndhuwur, conto kasebut dibuwang lan ditambahake 10 'Ca' tambahan.MAG Eremiobacterota wis dibalèkaké.Iki 16 MAG (ora ngetung loro sing wis ana ing basis data) nggawa total genom ing OMD sing ditambahi dadi 34.815.MAG ditugasake pangkat taksonomi adhedhasar podho genomik lan posisi ing GTDB.18 MAG wis dereplicated nggunakake dRep dadi 5 spesies (intraspecific ANI> 99%) lan 3 genera (intrageneric ANI 85% kanggo 94%) ing kulawarga padha79.Perwakilan spesies dipilih kanthi manual adhedhasar integritas, kontaminasi, lan N50.Nomenklatur sing disaranake diwenehake ing Informasi Tambahan.
Netepake integritas lan kontaminasi 'Ca.MAG Eremiobacterota, kita kabiji anané uscMG, uga set gene marker siji-salinan lan khusus domain sing digunakake dening CheckM lan Anvi'o.Identifikasi 2 duplikat saka 40 uscMGs dikonfirmasi dening rekonstruksi filogenetik (ndeleng ngisor) kanggo ngilangi kemungkinan kontaminasi (iki cocog karo 5% adhedhasar 40 gen panandha iki).Sinau tambahan saka limang wakil MAGs 'Ca.Tingkat rereged sing kurang ing génom sing direkonstruksi iki dikonfirmasi kanggo spesies Eremiobacterota nggunakake antarmuka Anvi'o interaktif adhedhasar korélasi komposisi kelimpahan lan urutan (Informasi Tambahan)59.
Kanggo analisis filogenomik, kita milih limang MAG wakil "Ca".Eudormicrobiaceae", kabeh spesies "Ca.Genom Eremiobacterota lan anggota filum liyane (kalebu UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria lan Planctomycetota) kasedhiya saka GTDB (r89)13.Kabeh génom iki dianotasi kaya sing wis diterangake sadurunge kanggo ekstraksi gen marker salinan tunggal lan anotasi BGC.Genom GTDB disimpen miturut kriteria integritas lan kontaminasi ing ndhuwur.Analisis filogenetik ditindakake kanthi nggunakake alur kerja Anvi'o Phylogenetics59.Wit iki dibangun nggunakake IQTREE (v.2.0.3) (opsi standar lan -bb 1000)80 ing Alignment saka 39 tandem ribosomal protein dikenali dening Anvi'o (OTOT, v.3.8.1551)81.Posisine suda.kanggo nutupi paling ora 50% saka genome82 lan Planctomycecota digunakake minangka outgroup adhedhasar topologi wit GTDB.Siji wit saka 40 uscMGs dibangun nggunakake alat lan paramèter sing padha.
Kita nggunakake Traitar (v.1.1.2) kanthi paramèter standar (fenotip, saka nukleotida)83 kanggo prédhiksi sipat mikroba umum.Kita njelajah gaya urip predator potensial adhedhasar indeks predator sing wis dikembangake sadurunge 84 sing gumantung saka isi gen pengkode protein ing genom.Secara khusus, kita nggunakake DIAMOND kanggo mbandhingake protein ing genom marang database OrthoMCL (v.4)85 nggunakake opsi –lebih-sensitif –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 AND count the gens related to gen penanda kanggo predator lan non-predator.Indeks punika prabédan antarane jumlah tandha predator lan ora predator.Minangka kontrol tambahan, kita uga nganalisa genom "Ca".Faktor Entotheonella TSY118 adhedhasar asosiasi karo Ca.Eudoremicrobium (ukuran genom gedhe lan potensial biosintetik).Sabanjure, kita nguji pranala potensial antarane gen penanda predator lan non-predator lan potensial biosintetik Ca.Eudormicrobiaceae" lan nemokake manawa ora luwih saka siji gen (saka jinis gen penanda apa wae, yaiku gen predator/non-predator) tumpang tindih karo BGC, nuduhake yen BGC ora ngganggu sinyal predasi.Anotasi genom tambahan saka replika scrambled ditindakake kanthi nggunakake TXSSCAN (v.1.0.2) kanggo mriksa khusus sistem sekresi, pili, lan flagella86.
Lima wakil 'Ca' dipetakan kanthi pemetaan 623 metatranscriptomes saka fraksi pengayaan prokariotik lan eukariotik saka segara Tara22,40,87 (nggunakake BWA, v.0.7.17-r1188, -a flag).Genom Eudormicrobiaceae.File BAM diproses nganggo FeatureCounts (v.2.0.1)88 sawise 80% maca jangkoan lan 95% panyaring identitas (kanthi pilihan featureCounts –primary -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Counts jumlah sisipan saben gen.Peta sing digawe dinormalisasi kanggo dawa gen lan kelimpahan gen marker mOTU (jumlah penyisipan rata-rata dawa sing dinormalisasi kanggo gen kanthi jumlah sisipan> 0) lan log-transformed dadi 22.74 kanggo entuk ekspresi relatif saben sel saben tingkat gen, sing uga nerangake variasi saka sampel menyang sampel sajrone urutan.Rasio kasebut ngidini analisis komparatif, nyuda masalah komposisi nalika nggunakake data kelimpahan relatif.Mung conto kanthi> 5 saka 10 gen penanda mOTU sing dianggep kanggo analisis luwih lanjut kanggo ngidini bagean genom sing cukup gedhe bisa dideteksi.
Profil transkriptom normal 'Ca.E. taraoceanii ngalami pengurangan dimensi nggunakake UMAP lan representasi sing diasilake digunakake kanggo clustering tanpa pengawasan nggunakake HDBSCAN (ndeleng ndhuwur) kanggo nemtokake status ekspresi.PERMANOVA nguji pinunjul saka beda antarane klompok dikenali ing asli (ora suda) papan jarak.Ekspresi diferensial antarane kondisi kasebut dites ing genom (ndeleng ndhuwur) lan 201 jalur KEGG diidentifikasi ing 6 gugus fungsi, yaiku: BGC, sistem sekresi lan gen flagellar saka TXSSCAN, enzim degradasi (protease lan peptidase), lan predator lan non- gen predator.tandha indeks predator.Kanggo saben sampel, kita ngetung ekspresi normalisasi rata-rata kanggo saben kelas (cathetan yen ekspresi BGC dhewe diitung minangka ekspresi median gen biosintetik kanggo BGC kasebut) lan dites kanggo pinunjul ing kabeh negara (test Kruskal-Wallis disetel kanggo FDR).
Gen sintetis dituku saka GenScript lan primer PCR dituku saka Microsynth.Phusion polimerase saka Thermo Fisher Scientific digunakake kanggo amplifikasi DNA.Plasmid NucleoSpin, gel NucleoSpin lan kit pemurnian PCR saka Macherey-Nagel digunakake kanggo pemurnian DNA.Enzim pembatasan lan ligase DNA T4 dituku saka New England Biolabs.Bahan kimia liyane saka isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) lan 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) dituku saka Sigma-Aldrich lan digunakake tanpa pemurnian luwih lanjut.Antibiotik kloramfenikol (Cm), spectinomycin dihydrochloride (Sm), ampisilin (Amp), gentamicin (Gt), lan carbenicillin (Cbn) dituku saka AppliChem.Komponen media Bacto Tryptone lan Bacto Yeast Extract dituku saka BD Biosciences.Trypsin kanggo urutan dituku saka Promega.
Urutan gen diekstrak saka anti-SMASH sing diprediksi BGC 75.1.E. malaspinii (Informasi tambahan).
Gen embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), lan embAM (kalebu wilayah intergene) diurutake minangka konstruk pdonR57 sing dioptimalake ing konstruk sintetik lan A nalika.Gen embA disubkloning dadi situs kloning kaping pisanan (MCS1) saka pACYCDuet-1(CmR) lan pCDFDuet-1(SmR) karo situs pembelahan BamHI lan HindIII.Gen embM lan embMopt (kodon-optimized) disubkloning dadi MCS1 pCDFDuet-1(SmR) karo BamHI lan HindIII lan diselehake ing situs kloning kaping pindho pCDFDuet-1(SmR) lan pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) kanthi NdeI/ChoI.Kaset embAM disubkloning dadi pCDFDuet1(SmR) kanthi situs cleavage BamHI lan HindIII.Gen orf3/embI (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) dibangun kanthi PCR ekstensi tumpang tindih nggunakake primer EmbI_OE_F_NdeI lan EmbI_OE_R_XhoI, dicerna nganggo enzim NdeI/XhoIFD, lan disambungake karo enzim NdeI/XhoIFD-1, lan disambungake menyang pCD-1 (pCD-1) sing padha. tambahan meja).6).Pencernaan lan ligasi enzim Watesan ditindakake miturut protokol pabrikan (New England Biolabs).