310 10 * 1mm Komponen kimia tabung baja tahan karat, Domain N-terminal saka spidroin mbentuk hidrogel adhedhasar fibril amiloid lan nyedhiyakake platform kanggo imobilisasi protein.

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Slider nuduhake telung artikel saben slide.Gunakake tombol mburi lan sabanjuré kanggo mindhah liwat minger, utawa tombol controller geser ing mburi kanggo mindhah liwat saben geser.

Spesifikasi

310 10*1mm Stainless steel coiled pipa pemasok

Komposisi kimia

Sifat Mekanik

Protein sutra laba-laba rekombinan (protein sutra laba-laba) nduweni akeh aplikasi potensial ing pangembangan biomaterial anyar, nanging sifate multimodal lan rawan agregasi ndadekake angel dipikolehi lan gampang digunakake.Ing kene kita nglaporake manawa protein spidroin miniatur rekombinan lan, sing penting, domain terminal N (NT) dhewe kanthi cepet mbentuk hidrogel mandiri lan transparan ing 37 °C.protein fusi sing kasusun saka NT lan protein fluoresensi ijo utawa fosforilase nukleosida purin mbentuk protein fusi kanthi fungsional.Hidrogel.Asil kita nuduhake yen protein NT lan fusi rekombinan nyedhiyakake ngasilake ekspresi sing dhuwur lan menehi hidrogel kanthi sifat sing menarik kayata transparansi, gelasi tanpa crosslinking, lan imobilisasi langsung protein aktif kanthi kapadhetan dhuwur.
Laba-laba duwe pitung set kelenjar sutra sing beda-beda, saben-saben ngasilake jinis sutra tartamtu.Kabeh pitung spesies sutra kasusun saka protein sutra laba-laba (spidroins) kira-kira 6000 residu lan ngemot wilayah ulang tengah sing gedhe sing diubengi dening domain terminal N- lan C-bola (NT lan CT)1,2.Jinis sutra sing paling akeh diteliti, ampulla primer, diprodhuksi dening kelenjar ampulla primer.Ing kelenjar iki, monolayer sel epitelium sintesis protein spidroin lan secretes menyang lumen kelenjar, ngendi padha ana ing wangun larut (doping) ing konsentrasi banget dhuwur (30-50% w/v)3,4.Organisasi lan konformasi protein spidroin ampullar utama ing kelenjar kasebut wis dibahas, nanging bukti eksperimen sing paling akeh nuduhake anané konformasi heliks umum lan / utawa acak lan struktur micellar utawa lamellar5,6,7,8,9,10.Nalika domain bola-bali ngatur sifat mekanik serat sutra, mbentuk nanocrystals β-sheet lan struktur amorf11,12,13,14,15, domain pungkasan ngatur serat sutra minangka respon kanggo owah-owahan kondisi ing sadawane kelenjar sutra16,17,18.Kanthi ngontrol formasi sutra, 19. Domain terminal dikonservasi sacara evolusioner lan fungsine bisa uga umum kanggo kabeh protein spidroin 2,20,21.Sajrone ngliwati kelenjar, pH spidroin mudhun saka udakara 7,6 dadi <5,716 lan mundhak kanthi geser lan regangan sing ditengahi kanthi gerakan liwat saluran sing rada sempit.Ing solusi, CT minangka dimer17 constitutive constitutive α-heliks, nanging kanggo nanggepi pH sing kurang lan gaya geser, CT mbukak lan ngalih β-layers16, 17, bisa uga nyebabake lapisan β ing wilayah sing bola-bali Convert 16. NT monomer ing ngisor. kahanan sing nggambarake kahanan ing lumen kelenjar lan mediasi kelarutan spidroin, nanging ing pH suda, protonasi sawetara rantai samping asam karboksilat ndadékaké dimerisasi NT kanthi pKa kira-kira 6,5, saéngga stabilisasi NT lan mbenakake spidroin kanthi gedhe. jumlah.jaringan16,18.Mangkono, NT nduweni peran kunci ing pambentukan filamen, ganti saka monomer ing lapisan menyang dimer ing serat23,24,25.NT tetep banget larut lan heliks ing kabeh kondisi sing ditliti nganti saiki16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, sing menehi inspirasi kanggo pangembangane minangka label sing nambah kelarutan kanggo produksi protein heterolog.
Protein sutra laba-laba mini rekombinan, dumadi saka siji NT, siji wilayah ulangan singkat, siji CT, lan tag His6 (His-NT2RepCT) kanggo pemurnian, larut ing buffer banyu kaya protein sutra laba-laba asli lan niru karakteristik penting asli laba-laba sutra. .jangkoan 25.31.His-NT2RepCT bisa dipintal dadi serat sing terus-terusan nggunakake mesin biomimetik sing lapisan larut pH 8 diekstrusi menyang adus banyu pH 525,32,33,34,35.Fermentasi bioreaktor E. coli sing nyatakake His-NT2RepCT lan sawise perawatan sawise ngasilake asil> 14 g / L sawise dimurnèkaké.Ngasilake dhuwur, kelarutan dhuwur, lan respon sing nyukupi saka His-NT2RepCT kanggo kahanan asam kabeh digandhengake karo NT23, 25, 34.
Ing kene kita nglaporake pembentukan hidrogel transparan kanthi cepet saka protèin spidroin rekombinan, kalebu NT piyambak, kanthi inkubasi larutan protein ing 37 °C.Nggunakake fluoresensi thioflavin T (ThT), spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR), spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) lan mikroskop elektron transmisi (TEM), kita nemokake yen protein NT lan microspider ngalami transformasi struktural dadi lembaran β lan fibril kaya amiloid. nalika gel dibentuk.Kajaba iku, protein fusi NT lan protein fluoresensi ijo (GFP) utawa purine nucleoside phosphorylase (PNP) mbentuk hidrogel kanthi fragmen fusi fungsional.Ekspresi high-throughput ing host heterologous, ditambah karo pembentukan hidrogel kanthi cepet ing kahanan fisiologis, mbukak kemungkinan produksi hidrogel kanthi biaya-efektif kanthi fungsi sing direkayasa.
Ora kaya protein spidroin rekombinan sing paling akeh dilaporake36, His-NT2RepCT stabil ing buffer Tris-HCl ing pH 8 lan bisa konsentrasi nganti 500 mg / mL tanpa presipitasi25.Mulane, kita kaget amarga protein iki kanthi cepet mbentuk hidrogel sing bisa didhukung kanthi optis nalika diinkubasi ing suhu 37 ° C (Gambar 1b-d).Panaliten luwih lanjut nuduhake yen Gelation His-NT2RepCT dumadi ing macem-macem konsentrasi protein (10-300 mg / mL) lan konsentrasi iki ana hubungane karo wektu gelation (Gambar 1c lan Gambar Tambahan 1).Kanggo ngerteni bagean saka His-NT2RepCT mediasi pembentukan hidrogel, kita banjur mriksa saben domain kanthi individu lan ing macem-macem kombinasi nggunakake uji inversi flask (Gambar 1a, b).Kabeh fraksi sing diuji saka spidroin rekombinan mbentuk gel (kanthi konsentrasi protein 300 mg / mL) kurang saka 1 jam, kajaba precipitated 2Rep (Fig. 1b).Iki nuduhake yen NT lan CT piyambak, ing kombinasi, utawa digandhengake karo mbaleni, bisa gel ing 37 ° C lan tag His6 ora mengaruhi proses iki ing sembarang ombone pinunjul.Amarga pangerten umum yen NT minangka protein sing larut lan stabil, lan laporan sadurunge babagan hidrogel spidroin rekombinan duweni efek gelasi kanggo owah-owahan konformasi ing wilayah ulang lan / utawa CT, NT dhewe bisa.Panemon gelation ora dikarepke.Tabel Tambahan 1) 37, 38, 39. Apik banget, NT wis gel ing 10 menit kanthi konsentrasi ≥ 300 mg / mL (Gambar 1c).Eksperimen inversi vial kanthi macem-macem konsentrasi NT nuduhake yen ing> 50 mg / mL larutan NT luwih cepet tinimbang His-NT2RepCT ing konsentrasi sing cocog (w / v, Gambar 1c).
Perwakilan skematis saka macem-macem konstruksi spidroin sing diteliti ing karya iki.b Wektu gel ing 37 °C kanggo macem-macem protein spidroin rekombinan (300 mg / mL) diverifikasi kanthi ngowahi vial.CT gel langsung tanpa inkubasi (<300 mg/mL), 2Rep endapan (300 mg/mL, skala 5 mm).c Wektu gel saka His-NT2RepCT lan NT ing konsentrasi protein sing dituduhake ing 37 ° C.d Foto-foto hidrogel His-NT2RepCT lan NT kanthi laba-laba lan huruf "NT" dicithak ing ngisor, masing-masing (loro 200 mg / mL, bar skala 5 mm).
Hidrogel sing dibentuk saka macem-macem protèin spidroin rekombinan nduweni warna sing rada beda, lan pengamatan mata telanjang nuduhake tingkat transparansi sing beda-beda (Gambar 1b).Gel NT cetha banget nalika gel liyane dadi buram.Kang-NT2RepCT lan NT gel matak menyang tabung silinder bisa dibusak saka jamur utuh (Fig. 1d).
Kanggo nguji apa gel lapisan sutra laba-laba alam ing kahanan sing saiki ditemokake nyebabake gelation saka protein spidroin rekombinan, lapisan diklumpukake saka kelenjar ampulla gedhe saka laba-laba jembatan Swedia (Larinioides sclopetarius).Lapisan disimpen ing buffer 20 mM Tris-HCl ing 50 mg / mL (adhedhasar bobot garing sing diukur), nanging ora ana gelation sing diamati sajrone inkubasi 21 dina ing 37 ° C (Tambahan Gambar 2a).
Kanggo ngitung gel kasebut, pangukuran rheologis bisa digunakake kanggo nyinaoni proses gelasi lan nemtokake sifat mekanik sakabèhé.Utamane, ngawasi modulus panyimpenan (elastisitas) ing suhu sing luwih dhuwur bisa menehi informasi babagan suhu gelling uga sifat viskoelastik saka lapisan kasebut.Eksperimen kenaikan suhu (nggunakake 1 ° C / min ing 25-45 ° C, adhedhasar studi sadurunge nggunakake solusi stok sutra alam) 40,41 nuduhake yen moduli panyimpenan saka solusi His-NT2RepCT lan NT tambah kanthi suhu sing tambah.tambah (Gambar 2 lan Gambar Tambahan 3).Utamane, modul NT wiwit tuwuh ing suhu sing luwih murah dibandhingake karo His-NT2RepCT, konsisten karo wektu gel sing luwih cepet nalika NT langsung diinkubasi karo His-NT2RepCT ing 37 ° C (Gambar 1).Sawise suhu mudhun, modulus panyimpenan ora bali menyang nilai sing luwih murah lan tetep ing ndhuwur modulus mundhut (pirsani Gambar Tambahan 3), nuduhake gelation stabil sing ora bisa dibatalake kanthi termal.Sawise gelation, modulus elastis pungkasan antara 15 nganti 330 kPa kanggo hidrogel His-NT2RepCT kanthi konsentrasi 100-500 mg / mL, lan modulus elastis pungkasan kanggo hidrogel NT (100-500 mg / mL) antara 2 nganti 1400. kPa (Fig., 2 lan data ramp lengkap) ndeleng Gambar Tambahan 3).
a Owah-owahan ing suhu sajrone pangukuran His-NT2RepCT (300 mg/mL) lan b NT (300 mg/mL) kanthi goyang.Panah nuduhake tren suhu, lan shading sing luwih entheng saka data modul panyimpenan nggambarake tes ing nilai torsi sing luwih murah kanggo instrumen tinimbang sing ditemtokake dening pabrikan, sing dadi penyebab gangguan.c Akumulasi modul pungkasan saka His-NT2RepCT lan NT sawise suhu dhuwur (100, 300, lan 500 mg / mL).Kabeh maca modul dijupuk ing frekuensi saka 0,1 Hz.
Minangka cara potensial kanggo nyelidiki owah-owahan konformasi sing ana hubungane karo gelation, kita nyathet spektrum FTIR saka His-NT2RepCT lan NT sadurunge lan sawise gelation ing 37 ° C (Gambar 3a, b).Kaya sing dikarepake, spektrum solusi His-NT2RepCT lan NT cocog karo protein sing nuduhake struktur sekunder α-helix / coil acak, kanthi pita sing diucapake ing 1645 cm-1.Kanggo loro hidrogel, gelation nyebabake pembentukan rong lengen ing pita tengah I kira-kira 1617 cm-1 lan 1695 cm-1 (Gambar 3a, b), sing nuduhake pembentukan struktur β-sheet antiparalel.Owah-owahan kasebut uga bisa dideleng kanthi jelas ing spektrum gelasi turunan lan bedane kaloro (Tambahan Gambar 4b).Rong pita lapisan β NT luwih cetha tinimbang His-NT2RepCT, nuduhake yen total isi pita lapisan β ing hidrogel NT luwih dhuwur tinimbang hidrogel NT2RepCT.
spektrum penyerapan FTIR saka His-NT2RepCT lan b NT (loro 500 mg / mL) sadurunge (solusi) lan sawise (gel) inkubasi ing 37 ° C.c gambar TEM saka 50 mg/ml NT2RepCT gel lan d NT.Skala bar 200 nm.e Serat diameteripun His-NT2RepCT lan NT hydrogels.n = 100 fibril sing diukur, p <0,0001.Bar kesalahan nuduhake standar deviasi.Pusat bar kesalahan yaiku rata-rata.Uji t sing ora berpasangan (loro buntut) digunakake kanggo analisis statistik.f ThT fluoresensi saka macem-macem protein spidroin rekombinan (100 mg / mL) ing 37 °C tanpa goyang.g NT (100 mg/mL) eksperimen inokulasi saka 100 mg/mL NT gel karo 0%, 5%, 10%, lan 20% wiji.
Analisis gel nggunakake mikroskop elektron transmisi (TEM) nuduhake yen hidrogel kasusun saka fibrils kaya amiloid (Gambar 3c, 3d).Fibrils NT-kawangun padha elongated (5-12 nm ing diameteripun) lan unbranched, nalika his-NT2RepCT fibrils padha luwih cendhek dawa lan Ngartekno jembar diameteripun (7-16 nm) (Fig. 3e).Asil kasebut ngidini kita ngetutake kinetika fibrosis nggunakake tes thioflavin T (ThT).Kanggo kabeh protein spidroin rekombinan, sinyal fluoresensi tambah nalika sampel diinkubasi ing 37 ° C (Gambar 3f, Gambar Tambahan 5a).Konsisten karo temuan iki, pemeriksaan mikroskopis NT lan His-NT2RepCT ing kondisi gelling nuduhake peningkatan seragam ing fluoresensi ThT tanpa akumulasi lokal agregat positif ThT (Tambahan Gambar 5b, c).Pembentukan fibrils ThT-positif ora diiringi paningkatan kekeruhan NT lan His-NTCT (Tambahan Gambar 5d), sing tegese jaringan fibril ing gel bisa dibentuk tanpa kompromi kejelasan gel.Seeding kanthi nambahake jumlah cilik fibril sing wis dibentuk bisa nyepetake pembentukan fibril saka sawetara amiloid42,43,44 nanging nambahake 5%, 10% utawa 20% (w/w) NT menyang larutan hidrokoagulan NT.efek seeding (Fig. 3g).Mbok menawa iki amarga fibril ing hidrogel relatif tetep lan ora bisa digunakake minangka wiji.
Prilaku sing ora dikarepke saka protèin spidroin rekombinan ing suhu dhuwur nyebabake studi spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) luwih lanjut kanggo ngenali owah-owahan konformasi sing ana hubungane karo pembentukan gel.Spektrum NMR saka solusi His-NT2RepCT sing direkam liwat wektu ing 37 ° C nuduhake yen CT isih sebagian dilipat, dene sinyal NT lan 2Rep wis ilang (Gambar 4a), nuduhake yen utamane NT lan 2Rep sing sebagian dikontrol pembentukan His- Hidrogel NT2RepCT.Sinyal CT uga dikurangi nganti 20% saka intensitas asline, nuduhake yen CT uga biasane tetep lan digabung menyang struktur hidrogel.Kanggo bagean cilik saka CT, kang minangka seluler minangka ing sampel preincubated lan kanthi mangkono diamati dening solusi NMR, spektrum lack sinyal kanggo 10 residu kabentuk pisanan, bisa amarga immobilization angel bagean ditempelake saka His-NT2Rep.Spektrum NMR saka -state of hydrogels -NT2RepCT ngungkapake predominan saka α-helices lan β-lapisan lan, ing tingkat sing luwih cilik, konformasi kumparan acak (Fig. 4b).Analisis shift kimia saka residu methionine mung ana ing NT nuduhake yen domain iki wis diowahi dadi struktur β-sheet.Spektrum gumantung wektu NT ing solusi nuduhake nyuda seragam ing intensitas sinyal (Fig. 4c), lan NMR negara padhet saka NT hydrogels nuduhake yen akeh residu NT diowahi dadi struktur β-sheet (Fig. 4d).Konformasi 2Rep ora bisa ditemtokake kanthi kapisah amarga cenderung nglumpukake.Nanging, spektrum NMR negara padhet saka hidrogel NTCT lan His-NT2RepCT katon meh padha (Gambar 4b; Gambar Tambahan 6b), nuduhake yen 2Rep nyumbang sethithik kanggo bagean struktural hidrogel His-NT2RepCT.Kanggo hidrogel CT, α-helices, β-sheets, lan struktur sekunder heliks acak ditemokake ana (Tambahan Gambar 6d).Iki nuduhake yen sawetara bagéan saka CT tetep α-heliks nalika liyane dadi β-sheet.Mangkono, asil spektroskopi NMR nuduhake yen NT penting kanggo pambentukan hidrogel lan uga ngowahi dadi konformasi β-sheet nalika fusi karo 2Rep lan CT.Selaras karo iki, kita bubar nemokake yen zippers spasial amyloid bisa dibentuk ing kabeh limang heliks saka domain NT, lan algoritma Waltz prédhiksi wilayah amyloidogenic ing helix 1 (Fig. 4e).
Spektrum 2D saka 15N-HSQC 10 mg/mL larutan His-NT2RepCT sadurunge (biru) lan 19 jam sawise inkubasi (abang) ing 37°C.Pucuk salib individu ing spektrum abang lan F24, G136, polyA ing spektrum biru dilambangake kanthi simbol asam amino huruf siji lan nomer residu.Inset nuduhake katergantungan intensitas sinyal ing wektu kanggo residu sing dipilih saka domain NT, 2Rep, lan CT.b Spektrum radiofrequency solid-state (RFDR) saka hidrogel His-NT2RepCT.Korélasi residu Cα / Cβ sing diamati ing spektrum RFDR ditemtokake kanthi mbandhingake karo owah-owahan kimia peptida model lan nilai sing diturunake saka statistik82,83 lan struktur sekunder.SSB - rotating sideband.c Spektrum siji-dimensi larutan 15N-HSQC 10 mg/mL NT sajrone inkubasi ing 37 °C suwene 36 jam.Inset nuduhake intensitas volumetrik lawan wektu.d Spektrum RFDR solid state saka hidrogel NT.Korélasi residu Cα / Cβ lan struktur sekunder sing diamati ing spektrum RFDR dituduhake.e Adhedhasar profil propensity fibrillation NT45.79 saka database Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Energi Rosetta saka jendhela shift kilat spasial saka hexapeptide ditampilake ing kkal / mol.Bar abang nuduhake heksapeptida kanthi propensity fibrosis dhuwur (energi Rosetta ngisor -23 kkal/mol; ngisor garis burik).Bar ijo nuduhake fragmen kanthi energi Rosetta ing ndhuwur ambang lan mulane kurang bisa mbentuk zippers sterik.Fragmen sing ngemot prolin ora kalebu saka analisis (tanpa kolom).Kothak nuduhake area amyloidosis sing diprediksi dening algoritma Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Urutan residu asam amino NT ana ing sisih ndhuwur, lan jinis residu sing ditemokake ing struktur sekunder β (ditemtokake dening spektroskopi NMR solid-state) ditampilake kanthi warna abang.Posisi saka limang NT α-heliks ditetepake minangka (H1-H5)28.
Ing pH <6,5, HT dadi dimerisasi, tahan kanggo denaturasi sing diakibatake panas utawa urea18.Kanggo njlentrehake carane dimerisasi lan stabilitas NT mengaruhi gelation, solusi sing ngemot 100 mg / ml NT dikontrol ing pH 8, 7, lan 6 nggunakake tes inversi vial.Sampel NT diinkubasi ing pH 8 lan 7 gel sawise 30 menit ing 37 ° C, nanging gel pH 8 tetep bening, dene gel pH 7 nuduhake endapan sing katon (Gambar 5a).Ing kontras, solusi sing ngemot HT ing pH 6 ora mbentuk gel, lan endapan gedhe bisa katon sawise 20 menit ing 37 ° C.Iki nuduhake yen dimer dhewe lan / utawa stabilitas sing luwih dhuwur tinimbang monomer nyegah gelation.Pembentukan endapan kanggo NT ing pH 7 lan 6 ora dikarepake, amarga wis dilaporake manawa NT larut ing 200 mg / ml27, gampang dilipat maneh sawise denaturasi panas, lan uga nahan α-helix ing nilai sing luwih murah. pH 18. Panjelasan kemungkinan kanggo bedo kasebut yaiku yen eksperimen sing dilapurake sadurunge ditindakake ing suhu kamar utawa ing ngisor, utawa ing konsentrasi protein sing relatif kurang16,18,19.
Tes inversi vial NT (100 mg/mL) ing pH 8, 7, 6 lan 154 mM NaCl (pH 8) sawise inkubasi ing 37°C.b spektrum CD NT kanthi lan tanpa 154 mM NaF lan 154 mM NaCl, masing-masing.Ellipticity molar ing 222 nm diowahi dadi proporsi lipatan alam.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C lan 60 °C), NTA72R (37 °C), lan His-NT-L6 (37 °C lan 60 °C).d spektrum CD mutan NT NT*, NTA72R, lan His-NT-L6.Ellipticity molar ing 222 nm diowahi dadi proporsi lipatan alam.e Tes inversi NTFlSp, NTMiSp lan NTMiSp suda (100 mg/mL).Skala bar 5 mm.f spektrum CD NT, NTFlSp, NTMiSp lan NTMiSp suda.Ellipticity molar ing 222 nm diowahi dadi proporsi lipatan alam.Spektrum NT lengkap ing 25 °C lan 95 °C ditampilake ing Gambar Tambahan 8.
Konsentrasi uyah fisiologis nemtokake interaksi elektrostatik antarane subunit NT lan dimerisasi transfer NT menyang pH18 sing luwih murah.Kita nemokake manawa anane 154 mM NaCl lan NaF pancen nyandhet gelation (Gambar 5a, b; Gambar Tambahan 2b) lan uyah kasebut nambah stabilitas termal monomer NT (Gambar 5b, Gambar Tambahan 8) .Iki uga nuduhake manawa nambah stabilitas, tinimbang dimerisasi, nyegah pembentukan gel.
Kanggo luwih njelajah peran dimerisasi lan stabilitas protein ing gelation, kita nggunakake rong mutan, NT * lan NTA72R, sing uga tetep monomer ing pH28.30 sing kurang.NT* minangka mutant pembalikan muatan ganda ing ngendi distribusi muatan dipolar monomer katon rata, sing nyegah dimerisasi lan nambah stabilitas monomer kanthi drastis.NTA72R minangka dipole sing diisi, nanging Ala sing diganti Arg dumunung ing wates dimer, mula mutasi ngganggu interaksi subunit sing dibutuhake kanggo dimerisasi.Sawise inkubasi ing 37 ° C, NT * ora mbentuk hidrogel, nalika NTA72R mbentuk gel opaque kanggo 15 menit (Gambar 5c).Wiwit loro NT * lan NTA72R ora bisa dimerize nanging beda ing stabilitas monomer (Fig. 5d), asil iki banget suggest sing stabilitas termodinamika dhuwur ngalangi NT saka gelling.Iki uga didhukung dening kasunyatan sing HT * mbentuk gel nalika ora stabil ing suhu dhuwur (sawise 8 min ing 60 ° C; Fig. 5c).Sadurungé wis ditampilake sing isi dhuwur methionine ing NT liquefies lempitan alam lan enem Met kanggo substitusi Leu (diarani kene His-NT-L6) kuwat stabil monomer NT46.Adhedhasar asumsi yen keluwesan struktural dibutuhake kanggo pembentukan gel NT, kita nemokake yen mutan stabil His-NT-L6 ora gel ing 37 ° C (Gambar 5c, d).Nanging, His-NT-L6 uga mbentuk gel nalika inkubasi ing 60 ° C suwene 60 menit (Gambar 5c).
Kemampuan NT kanggo ngowahi dadi struktur β-sheet lan mbentuk hidrogel katon ditrapake kanggo sawetara nanging ora kabeh domain NT saka spidroin.NT saka macem-macem jinis sutra lan spesies laba-laba, Trichonephila clavipes (NTFlSp), mbentuk gel sanajan isi methionine sing relatif kurang lan stabilitas termal dhuwur (Fig. 5e, f lan Tabel Tambahan 2).Ing kontras, NT saka spidroin protein ampullar cilik saka Araneus ventricosus (NTMiSp) kanthi stabilitas termal sing kurang lan isi methionine sing dhuwur ora mbentuk hidrogel (Tabel Tambahan 2 lan Gambar 5e, f).Sing terakhir bisa digandhengake karo anané ikatan disulfida intramolekul29,47.Secara konsisten, nalika ikatan disulfida NTMiSp dikurangi, mbentuk hidrogel sawise inkubasi ing 37 ° C suwene 10 menit (Gambar 5e).Ing kesimpulan, kudu dicathet yen keluwesan struktural minangka kriteria penting, nanging ora mung kanggo pambentukan gel saka NT.Faktor liyane sing bisa uga relevan yaiku kecenderungan kanggo mbentuk fibril amiloid, lan analisis karo database zipper lan algoritma Waltz nuduhake korélasi antara kemampuan kanggo mbentuk gel lan anané wilayah amiloid, uga jembar wilayah sing diprediksi. kanggo mbentuk zippers sterik.Ana korélasi (Tabel Tambahan 2 lan Gambar Tambahan 9).
Kemampuan NT kanggo mbentuk fibrils lan mbentuk gel ing kahanan sarujuk mimpin kita kanggo hypothesize sing fusi NT karo pecahan protein liyane isih bisa mbentuk gel karo fungsi lengkap partners fusi.Kanggo nguji iki, kita ngenalake protein fluoresensi ijo (GFP) lan purine nucleoside phosphorylase (PNP) ing C-terminus NT, masing-masing.Protein fusi sing diasilake dituduhake ing E. coli kanthi asil pungkasan sing dhuwur banget (150 mg / L lan 256 mg / L kultur flask goyang kanggo His-NT-GFP lan His-NT-PNP, masing-masing), konsisten karo sing dituduhake. kanggo Protein liya sing digabung karo NT Ref.30. Protein fusi His-NT-GFP (300mg / mL) lan His-NT-PNP (100mg / mL) mbentuk gel sawise 2 jam lan 6,5 jam ing 37 ° C lan, sing penting, fraksi GFP tetep ora owah.diamati sawise gelation, kanthi> 70% saka intensitas fluoresensi awal tetep sawise gelation (Gambar 6a).Kanggo ngukur aktivitas PNP ing solusi lan gel-NT-PNP, kita kudu ngencerake protein fusi karo NT amarga aktivitas enzimatik saka persiapan murni ana ing njaba jangkauan deteksi tes ing konsentrasi gelling.Gel sing dibentuk kanthi campuran sing ngemot 0,01 mg / mL His-NT-PNP lan 100 mg / mL NT nahan 65% saka aktivitas enzimatik awal saka sampel sing wis diinkubasi (Gambar 6b).Gel tetep utuh sajrone pangukuran (Tambahan Gambar 10).
Intensitas fluoresensi relatif sadurunge lan sawise gelation His-NT-GFP (300 mg/mL) lan vial terbalik sing ngemot hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) ing cahya sing katon lan UV.Titik nuduhake pangukuran individu (n = 3), bar kesalahan nuduhake standar deviasi.Nilai rata-rata ditampilake ing tengah bar kesalahan.Aktivitas PNP dipikolehi kanthi analisis fluorometrik nggunakake solusi lan gel sing kasusun saka NT (100 mg / ml) lan campuran sing ngemot 0,01 mg / ml his-NT-PNP lan 100 mg / ml dolar Taiwan Anyar.Inset nuduhake vial terbalik sing ngemot hidrogel sing ngemot His-NT-PNP (bar skala 5 mm).
Ing kene, kita nglaporake pembentukan hidrogel saka NT lan protein spidroin rekombinan liyane kanthi inkubasi larutan protein ing 37 ° C (Gambar 1).Kita nuduhake yen gelation digandhengake karo transformasi α-heliks dadi lapisan β lan pembentukan fibril kaya amiloid (Gambar 3 lan 4).Temuan iki nggumunake amarga NT minangka bundle globular lima heliks sing dikenal kanthi kelarutan sing dhuwur banget lan stabilitas sing dhuwur ing konsentrasi> 200 mg / mL ing 4 ° C kanggo sawetara dina27.Kajaba iku, NTs gampang refold sawise denaturasi panas ing konsentrasi protein kurang ing µM.Miturut asil kita, pembentukan fibril mbutuhake kombinasi > 10 mg / mL konsentrasi protein lan suhu rada munggah (Gambar 1).Iki cocog karo gagasan yen fibril amiloid bisa dibentuk saka protèin sing dilipat globular sing ana ing kahanan sing ora dilipat amarga fluktuasi termal ing kahanan fisiologis 48 .Conto protein sing ngalami konversi iki kalebu insulin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin lan lisozim51,52,53.Sanajan NT minangka α-helix ing negara asale, kira-kira 65% saka rantai polipeptida kompatibel karo pembentukan zipper sterik (Gambar 4e) 45 .Amarga monomer iku dynamically mobile46, bisa mbabarake wilayah amyloidogenic potensial iki ing suhu moderat munggah pangkat lan ing konsentrasi dhuwur saka total protein bisa tekan konsentrasi kritis kanggo formasi fibril amyloid54.Sawisé alesan iki, kita nemokake korélasi negatif antarane konsentrasi spidroin lan wektu gelation (Fig. 1c), lan yen konformasi NT monomerik stabil kanthi mutasi (NT*, His-NT-L6) utawa kanthi tambahan uyah, bisa nyegah hidrogel tatanan (Gambar 5).
Umume kasus, fibril amiloid ilang saka solusi minangka precipitate, nanging ing kahanan tartamtu bisa mbentuk hidrogel55,56,57.Fibrils mbentuk hidrogel biasane duwe rasio aspek dhuwur lan mbentuk jaringan telung dimensi sing stabil liwat entanglement molekul, 55,58 konsisten karo asil kita.Kanggo pambentukan hidrogel in vitro, protèin asring kabuka kanthi lengkap utawa sebagian, contone, kanthi paparan pelarut organik, suhu dhuwur (70–90°C) lan/utawa pH kurang (1.5–3.0)59,60,61,62.Hidrogel spidroin sing diterangake ing kene ora mbutuhake pangolahan sing keras, uga ora mbutuhake agen penghubung silang kanggo nyetabilake hidrogel.
Sadurungé wis dilapurake manawa spidroin mbaleni lan QD, sing katon ngalami owah-owahan β-sheet sajrone pemintalan sutra, mbentuk hidrogel.Dibandhingake karo temuan kita, wektu inkubasi lan / utawa suhu inkubasi luwih suwe utawa luwih dhuwur, lan hidrogel sing diasilake asring buram (Gambar 7 lan Tabel Tambahan 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Saliyane kaping gel cepet, hidrogel NT> 300 mg / mL (30%) ngluwihi kabeh hidrogel protein sutra laba-laba rekombinan liyane sing diterangake, uga hidrogel alami kayata gelatin, alginat (2%), agar (0,5 % ) lan kolagen.(0,6%) (Gambar 7 lan Tabel Tambahan 1 lan 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Wektu gel lan modulus elastis saka hidrogel ing panliten iki dibandhingake karo hidrogel adhedhasar spidroin liyane lan hidrogel alami sing dipilih.Referensi diwenehi bebarengan karo gambaran saka kondisi gelation.APS Amonium persulfate, suhu kamar.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Laba-laba katon wis ngembangake cara kanggo nyegah spidroin dadi gel sajrone panyimpenan.Senadyan konsentrasi protein sing dhuwur ing kelenjar sutra, wilayah baleni gedhe sing digandhengake karo domain terminal tegese konsentrasi NT lan CT sing katon ing kelenjar cocog karo kira-kira 10-20 mg / ml, ing wates panliten iki.dibutuhake kanggo pambentukan hidrogel sing diamati ing vitro.Kajaba iku, konsentrasi uyah sing padha 16 stabil NT, kaya ing kelenjar sutra (Gambar 5b).Konformasi NT wis diteliti ing sitosol E. coli lan ditemokake luwih kenceng tinimbang nalika diteliti ing vitro, luwih nuduhake yen uyah utawa faktor liya nyegah agregasi ing vivo.Nanging, kemampuan NT kanggo ngowahi dadi fibril β-sheet bisa uga penting kanggo pambentukan filamen lan kudu diselidiki ing studi sabanjure.
Saliyane ing aspek novel NT-amyloid-kaya fibril lan formasi hidrogel diamati ing panliten iki, kita uga nuduhake yen fenomena iki bisa uga duwe aplikasi bioteknologi lan biomedis (Gambar 8).Minangka bukti konsep, kita gabungke NT karo GFP utawa PNP lan nuduhake yen protein fusi uga mbentuk hidrogel nalika diinkubasi ing 37 ° C lan fraksi GFP lan PNP umume nahan aktivitas sawise gelation (Gambar 6).Fosforilase nukleosida minangka sintesis katalis penting saka analog nukleosida75, sing ndadekake panemuan kita relevan kanggo industri biofarmasi.Konsep ekspresi protein fusi sing mbentuk hidrogel transparan ing kahanan sing cocog ngidini nggawe hidrogel fungsional kanthi sifat sing cocog kanggo macem-macem aplikasi kayata imobilisasi enzim, pelepasan obat sing dikontrol lan teknik jaringan.Kajaba iku, NT lan NT* minangka penanda ekspresi sing efisien30, tegese NT lan varian kasebut bisa digunakake kanggo produksi protein fusi larut lan nggawe protein target sing ora bisa digerakake ing hidrogel 3D.
NT larut, α-heliks lan stabil ing konsentrasi rendah (µM) lan 37°C.Ing suhu sing padha, nanging nalika nambah konsentrasi (> 10 mg / ml), NT mbentuk gel sing kasusun saka fibril kaya amiloid.Protein fusi NT uga mbentuk gel fibrillar kanthi fragmen fusi sing fungsional, ngidini macem-macem protein bisa diimobilisasi ing hidrogel 3D nggunakake NT.Ngisor: NT (PDB: 4FBS) lan ilustrasi jaringan serat lan struktur protein sing gegandhengan (dianggap lan ora digambar ing skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstruksi (pirsani Tabel Tambahan 4 kanggo dhaptar lengkap kalebu urutan asam amino) dikloning dadi plasmid pT7 lan diowahi dadi E. coli BL21 (DE3).E. coli sing ngemot plasmid rekayasa diinokulasi ing duduh kaldu Luria sing ditambah karo kanamisin (70 mg / l) lan ditanam ing wayah wengi kanthi suhu 30 ° C lan 250 rpm.Kultur kasebut banjur diinokulasi 1/100 ing medium LB sing ngandhut kanamisin lan dikultur ing suhu 30°C lan 110 rpm nganti OD600 tekan 0,8.Kanggo studi NMR, bakteri ditanam ing medium minimal M9 sing ngemot 2 g D-glukosa 13C (Aldrich) lan 1 g amonium klorida 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) kanggo label protein kanthi isotop.Ngurangi suhu nganti 20 derajat Celsius lan ngindhuksi ekspresi protein kanthi 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (konsentrasi akhir).Sawise ekspresi protein sewengi, sel dipanen ing 7278 × g, 4 ° C suwene 20 menit.Pelet sel digantung maneh ing 20 mM Tris-HCl, pH 8, lan beku nganti digunakake maneh.Sèl sing dicairaké dililisis nganggo disruptor sel (mesin seri TS, Constant Systems Limited, Inggris) kanthi 30 kPa.Banjur lysates disentrifugasi ing 25.000 g suwene 30 menit ing suhu 4 ° C.Kanggo NTMiSp, pelet iki banjur resuspended ing 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, lan sonicated kanggo 2 min (2 s on/off, 65%), banjur centrifuged maneh ing 25.000 xg, 4 ° C. ing. 30 min.Supernatan kasebut dimuat ing kolom Ni-NTA, dicuci nganggo 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, lan pungkasane protein diencerake nganggo 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Kanggo ngasilake NT2RepCT lan NTCT, pencernaan thrombin ngenalaken situs (ThrCleav) antarane Kang lan NT.Situs pembelahan trombin uga ana ing His-NT-ThrCleav-2Rep (ngasilake 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ngasilake NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ngasilake CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (ngasilake NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (ngasilake NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (ngasilake NTF1Sp), lan His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (ngasilake NTMiSp).Konstruksi kasebut dicerna nganggo trombin (1: 1000) lan dialisis sewengi ing 4 ° C. kanthi 20 mM Tris-HCl, pH 8, nggunakake membran dialisis Spectra / Por kanthi ambang bobot molekul 6-8 kDa.Sawise dialisis, solusi kasebut dimuat menyang kolom Ni-NTA lan efluen sing ngemot protein sing dikarepake dikumpulake.Konsentrasi protein ditemtokake kanthi ngukur absorbansi UV ing 280 nm nggunakake koefisien kepunahan saben protein, kajaba NTF1Sp, sing nggunakake tes Bradford miturut protokol pabrikan.Kemurnian ditemtokake dening elektroforesis gel SDS polyacrylamide (4-20%) lan pewarnaan biru Coomassie sarwa.Protein dikonsentrasi nggunakake saringan centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) ing 4000 xg kanthi potongan bobot molekul 10 kDa ing siklus 20 menit.
Cair solusi protein lan kanthi ati-ati pipet 150 µl menyang vial septum bening 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tabung kasebut ditutup lan disegel karo parafilm kanggo nyegah penguapan.Sampel (n = 3) diinkubasi ing 37 ° C utawa 60 ° C lan dibalik kanthi periodik kanggo mirsani gelation.Sampel sing ora dadi gel diinkubasi paling ora seminggu.Ngurangi ikatan disulfida NTMiSp kanthi 10 mM DTT saben 10 µM protein.Kanggo nganalisa gelation lapisan sutra laba-laba alami, laba-laba jembatan Swedia dipotong, loro kelenjar ampullated utama diselehake ing 200 μl 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 lan dipotong kanggo ngidini lapisan kasebut misah saka kelenjar..Isi kelenjar dibubarake ing buffer, 50 µl kanggo nemtokake bobot garing (kanthi inkubasi bokor mbukak ing 60 °C nganti bobot konstan) lan 150 µl kanggo gelation ing 37 °C.
Geometri/alat ukur digawe saka stainless steel nggunakake piring paralel kanthi diameter ndhuwur 20 mm lan celah 0,5 mm.Kalorake sampel saka 25 °C nganti 45 °C lan bali menyang 25 °C kanthi kecepatan 1 °C saben menit nggunakake piring Peltier ngisor stainless steel.Pangukuran vibrasi ditindakake kanthi frekuensi 0,1 Hz lan ing wilayah viskoelastik linier materi kanthi galur 5% lan 0,5% kanggo sampel 100 mg / mL lan 300-500 mg / mL, masing-masing.Gunakake kamar kelembapan khusus kanggo nyegah penguapan.Data dipunanalisis ngginakaken Prisma 9.
Kanggo ngumpulake spektrum inframerah (IR) ing suhu kamar saka 800 nganti 3900 cm–1.Piranti ATR, uga jalur cahya liwat spektrometer, diresiki nganggo udara sing disaring garing sadurunge lan sajrone eksperimen.Solusi (500 mg / mL kanggo nyilikake puncak panyerepan banyu ing spektrum) dipipet menyang kristal, lan gel (500 mg / mL) dibentuk sadurunge pangukuran banjur ditransfer menyang kristal (n = 3).1000 scan direkam kanthi resolusi 2 cm-1 lan siklus tugas nul 2. Turunan kapindho diwilang nggunakake OPUS (Bruker) nggunakake sawetara smoothing saka sangang TCTerms.Spektrum dinormalisasi menyang wilayah integrasi sing padha antarane 1720 lan 1580 cm-1 nggunakake F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Ing spektroskopi ATR-IR, ambane penetrasi sinar infra merah menyang sampel gumantung saka nomer gelombang, sing nyebabake panyerepan luwih kuat ing nomer gelombang sing luwih murah tinimbang ing nomer gelombang sing luwih dhuwur.Efek kasebut durung didandani kanggo spektrum sing ditampilake ing Fig.3 amarga padha cilik banget (Tambahan Fig. 4).Spektrum sing didandani kanggo tokoh iki diwilang nggunakake piranti lunak Bruker OPUS.
Prinsip, kuantifikasi lengkap konformasi protein bisa ditindakake sawise dekonvolusi sing dipercaya saka komponen ing puncak amida I.Nanging, sawetara alangan muncul ing laku.Swara ing spektrum bisa katon minangka puncak (palsu) nalika dekonvolusi.Kajaba iku, puncak amarga mlengkung banyu bertepatan karo posisi puncak amida I lan bisa uga duwe magnitudo sing padha kanggo conto sing ngemot banyu akeh, kayata gel banyu sing diteliti ing kene.Mula, kita ora nyoba ngrusak puncak amida I kanthi lengkap, lan pengamatan kita mung kudu dianggep minangka dhukungan kanggo metode liya kayata spektroskopi NMR.
Solusi saka 50 mg / ml NT lan His-NT2RepCT digawe gel ing wayah wengi ing 37 ° C.Hidrogel kasebut banjur diencerake kanthi 20 mM Tris-HCl (pH 8) nganti konsentrasi 12,5 mg/ml, dikocok kanthi apik lan dipipet kanggo ngilangi gel.Sabanjure, hidrogel diencerake kaping 10 kanthi 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl saka sampel ditrapake ing kothak tembaga sing dilapisi formvar, lan sampel sing berlebihan dibusak nganggo kertas blotting.Sampel dikumbah kaping pindho nganggo 5 µl banyu MilliQ lan diwarnai nganggo format uranil 1% suwene 5 menit.Copot noda sing berlebihan nganggo kertas penyerap, banjur garingake bolong.Imaging dileksanakake ing kothak iki nggunakake FEI Tecnai 12 Roh BioTWIN operasi ing 100 kV.Gambar kasebut direkam kanthi perbesaran x 26.500 lan x 43.000 nggunakake kamera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Jerman).Kanggo saben sampel (n = 1), 10-15 gambar direkam.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) digunakake kanggo analisis gambar lan pangukuran diameter serat (n = 100, serat beda).Prisma 9 digunakake kanggo nindakake tes-t tanpa pasangan (loro buntut).Rata-rata serat His-NT2RepCT lan NT yaiku 11.43 (SD 2.035) lan 7.67 (SD 1.389) nm.Interval kapercayan (95%) yaiku -4,246 nganti -3,275.derajat kebebasan = 198, p <0,0001.
80 µl sampel Cairan ngemot 10 µM thioflavin T (ThT) diukur ing rangkap tiga (n = 3) ing kahanan statis nggunakake Corning 96-sumur ireng ngisor bening piring ngisor (Corning Glass 3881, USA).Bedane fluoresensi dicathet nggunakake panyaring eksitasi 440 nm lan panyaring emisi 480 nm (FLUOStar Galaxy saka BMG Labtech, Offenburg, Jerman).Sinyal ThT ora kebak utawa dipateni, amarga eksperimen karo konsentrasi ThT sing beda ditindakake tanpa ngganti intensitas sinyal.Rekam penyerapan ing 360 nm kanggo pangukuran kabut.Kanggo eksperimen seeding, gel 100 mg / mL dibentuk ing 37 ° C., digantung maneh, lan digunakake kanggo seeding ing rasio molar 5%, 10%, lan 20%.Data dipunanalisis ngginakaken Prisma 9.
Cairan stok His-NT2RepCT lan NT> 100 mg/mL ing es lan saring liwat saringan 0,22 µm.Konsentrasi diitung kanthi ngukur absorbansi ing 280 nm nggunakake Nanodrop.Ing sumur 96 sumur ireng non-binding plate (Corning) kanthi dhasar bening, sampel diencerke nganti 20 mg/ml ing 20 mM Tris-HCl pH 8 lan dicampur karo 5 μM ThT (konsentrasi akhir), konsentrasi sampel total volume 50 μl.Sampel dicithak saben menit 10 ing 37 ° C ing mikroskop CellObserver (Zeiss) kanthi saluran cahya sing ditularake lan set filter eksitasi lan emisi FITC kanggo pencitraan ThT.Lensa 20x/0.4 digunakake kanggo pencitraan.Zen Blue (Zeiss) lan ImageJ (https://imagej.nih.gov/) digunakake kanggo analisis gambar.Gel uga disiapake saka solusi NT lan His-NT2RepCT kanthi konsentrasi 50 mg / mL sing ngemot 20 mM Tris pH 8 lan 5 µM ThT lan diinkubasi ing 37 ° C suwene 90 menit.Potongan gel ditransfer menyang sumur anyar sing ngemot 20 mM Tris, pH 8, lan 5 μM ThT ing plat ngisor 96 sumur bening ireng sing ora ikatan.Entuk fluoresensi ijo lan gambar lapangan padhang kanthi perbesaran 20x/0,4.ImageJ digunakake kanggo analisis gambar.
Solusi spektrum NMR dipikolehi ing 310 K ing spektrometer Bruker Avance Neo 600 MHz sing dilengkapi QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Sampel NMR ngemot 10 mg/mL protein homogen kanthi label 13C, 15N, larut ing 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Pergeseran kimia NT2RepCT ing pH 6.7 digunakake kanggo nemtokake puncak 23 ing spektrum 2D 15N-HSQC.
Sudut ajaib spinning spektrum NMR (MAS) padhet saka 13C, 15N-label hydrogels kacathet ing spektrometer Bruker Avance III HD ing 800 MHz dilengkapi 3,2 mm 13C / 15N {1H} probe electronless.Suhu sampel dikontrol kanthi nggunakake aliran gas suhu variabel ing 277 K. Resonansi rotasi dipole rong dimensi (DARR) 76 lan spektrum reconnection frekuensi radio (RFDR) 77 dipikolehi ing frekuensi MAS 12,5 kHz lan 20 kHz, masing-masing.Polarisasi silang (CP) saka 1H nganti 13C ditindakake kanthi nggunakake ramp linear saka 60,0 nganti 48,0 kHz ing 1H, 61,3 / 71,6 kHz ing 13C (ing 12,5 / 20 kHz MAS) lan wektu kontak 0,5-1 ms.Spinal6478 decoupling ing 73,5 kHz digunakake nalika nglumpukake data.Wektu akuisisi yaiku 10 milidetik lan wektu tundha siklus yaiku 2,5 detik.Korelasi Cα/Cβ sing disambung siji sing diamati ing spektrum RFDR ditugasake adhedhasar owah-owahan kimia jinis residu karakteristik lan korélasi multiply-linked ing spektrum DARR.
Database Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) digunakake kanggo ngevaluasi tendensi flutter lan energi Rosetta kanggo NT, NTFlSp, lan NTMiSp.Database Zipper ngitung Rosetta Energy80, sing nggabungake sawetara fungsi energi gratis kanggo model lan nganalisa struktur protein.Tingkat energi -23 kkal / mol utawa luwih murah nuduhake kecenderungan fibrilasi sing dhuwur.Energi sing luwih murah tegese luwih stabil saka rong untaian β ing konformasi zipper.Kajaba iku, algoritma Waltz digunakake kanggo prédhiksi wilayah amyloidogenic ing NT, NTFlSp lan NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Larutan protein NT dicampur karo buffer asam 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ing pH 5,5 lan 6,0 kanggo ngedhunake pH dadi pH 6 lan 7.Konsentrasi protein pungkasan yaiku 100 mg / ml.
Pangukuran ditindakake ing spektrometer CD J-1500 (JASCO, USA) nggunakake kuvet 300 μL kanthi jalur optik 0,1 cm.Protein diencerke nganti 10 μM (n = 1) ing buffer fosfat 20 mM (pH 8).Kanggo nganalisa stabilitas protein ing ngarsane uyah, protein dianalisis kanthi konsentrasi sing padha (n = 1) ing buffer fosfat 20 mM (pH 8) sing ngemot 154 mM NaF utawa NaCl.Pindai suhu direkam ing 222 nm saka 25 ° C nganti 95 ° C kanthi tingkat pemanasan 1 ° C / min.Proporsi protein sing dilipat asli diwilang nggunakake rumus (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Kajaba iku, limang spektrum direkam kanggo saben sampel saka 260 nm nganti 190 nm ing 25 ° C lan sawise dadi panas nganti 95 ° C.Lima spektrum padha rata-rata, smoothed lan diowahi kanggo ellipticity molar.Data dipunanalisis ngginakaken Prisma 9.
Intensitas fluoresensi His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) diukur kanthi rangkap tiga (n = 3) ing piring Corning 96 sumur kanthi dhasar transparan ireng (Corning Glass 3881, USA) ing kahanan statis.Ukur conto kanthi maca piring adhedhasar fluoresensi kanthi dawa gelombang eksitasi 395 nm lan rekam emisi ing 509 nm sadurunge gelation lan 2 jam mengko ing 37 ° C.Data dianalisis nganggo Prisma 9.
Kit assay aktivitas nukleosida fosforilase purin (metode fluorometrik, Sigma Aldrich) digunakake miturut instruksi pabrik.Kanggo ngukur aktivitas ing gel lan solusi sing ngemot His-NT-PNP, campur 10 ng His-NT-PNP karo 100 mg/mL NT nganti volume total 2 µL amarga gel menehi sinyal ing ndhuwur interval deteksi set kasebut.Kontrol kanggo gel lan solusi tanpa His-NT-PNP kalebu.Pangukuran ditindakake kaping pindho (n = 2).Sawise aktivitas diukur, campuran reaksi dibusak lan gel difoto kanggo mesthekake yen gel tetep utuh sajrone pangukuran.Data dipunanalisis ngginakaken Prisma 9.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain sinau, waca abstrak sinau Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.
Gambar 1 lan 2 nampilake data wiwitan.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, lan 6, Gambar Tambahan.3, Gambar tambahan.5a, d, gambar tambahan.6 lan anjir tambahan.8. Dhata Dhata saka panliten iki ana ing basis data Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Data NMR sing dipikolehi ing panliten iki dikirim menyang gudang BMRBig ing ID entri bmrbig36.Struktur GFP lan PNP dijupuk saka PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. lan Johansson, J. Spinning sutra laba-laba buatan.Kimia Nasional.biologi.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Genom Nephila clavipes nyorot keragaman gen sutra laba-laba lan ekspresi kompleks.Generasi Nasional.49, 895–903 (2017).