347 12.7*1.24mm Tabung baja tahan karat, Mekanisme molekuler kondensasi elektrostatik sinkron lan koagregasi α-synuclein lan tau

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Slider nuduhake telung artikel saben slide.Gunakake tombol mburi lan sabanjuré kanggo mindhah liwat minger, utawa tombol controller geser ing mburi kanggo mindhah liwat saben geser.

347 Spesifikasi Pipa Stainless Steel

347 12.7*1.24mm Pipa baja tahan karat

Diameter njaba: 6,00 mm OD nganti 914,4 mm OD, Ukuran nganti 24 "NB kasedhiya Ex-stock, OD Size Steel Tubes kasedhiya Ex-stock

SS 347 Range Ketebalan Pipa: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, lsp. (0.5-12mm) Utawa ukuran non-reguler sing kudu dicocogake

Tipe: SS 347 Pipa Mulus |Pipa SS 347 ERW |SS 347 Pipa Las |SS 347 Fabrikasi Pipa |SS 347 CDW Tabung, LSAW Pipa / Jahitan-dilas / Redrawn

Bentuk: Pipa/Tabung Bulat SS 347, Pipa/Tabung Persegi SS 347, Pipa/Tabung Persegi Panjang SS 347, Tabung Koil SS 347, Bentuk “U” SS 347, Gulungan Kue Panci SS 347, Tabung Hidrolik SS 347

Length: Single Random, Double Random & Required Length End: Plain End, Beveled End, Treaded

Perlindhungan pungkasan: Tutup Plastik |Rampung njaba: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Rampung kanggo Pipa Stainless Steel, Rampung miturut Requirements customer

Kahanan Pangiriman: Anil lan Acar, Dipoles, Anil Padhang, Digambar Dingin

Inspeksi, Laporan Tes: Sertifikat Pengujian Pabrik, EN 10204 3.1, Laporan Kimia, Laporan Mekanik, Laporan Tes PMI, Laporan Inspeksi Visual, Laporan Inspeksi Pihak Katelu, Laporan Lab sing Disetujui NABL, Laporan Tes Rusak, Laporan Tes Non ngrusak

Packing: Dikempalken ing Kothak Kayu, Kantong Plastik, Strip Baja Dibundel, utawa miturut Panjaluk Pelanggan

Spesial: Ukuran lan Spesifikasi liyane saka ndhuwur bisa diprodhuksi miturut panyuwunan

SS 347 Range Ukuran Pipa: 1/2 inci NB, OD nganti 24 inci

ASTM A312 347: Pipa austenitik las mulus lan lurus sing dilas kanggo suhu dhuwur lan layanan korosif umum.Logam pangisi ora diidini sajrone ngelas.

ASTM A358 347: Pipa austenitik sing dilas fusi listrik kanggo layanan korosif lan / utawa suhu dhuwur.Biasane mung pipa nganti 8 inci sing diprodhuksi kanggo spesifikasi iki.Penambahan logam pengisi diijini sajrone welding.

ASTM A790 347: Pipa feritik/austenitik (duplex) sing dilas mulus lan lurus sing dilas kanggo layanan korosif umum, kanthi penekanan khusus kanggo resistensi retak korosi stres.

ASTM A409 347: Gabungan listrik jahitan lurus utawa spiral sing dilas pipa tembok austenitik diameter gedhe kanthi ukuran 14 "nganti 30" kanthi tembok Sch5S lan Sch 10S kanggo korosif lan / utawa dhuwur

ASTM A376 347: Pipa austenitik mulus kanggo aplikasi suhu dhuwur.

ASTM A813 347: Pipa austenitik sing dilas tunggal, siji utawa pindho kanggo suhu dhuwur lan aplikasi korosif umum.

ASTM A814 347: Pipa austenitik las sing digawe adhem kanggo suhu dhuwur lan layanan korosif umum.

347H Pipa Stainless Steel Komposisi Kimia

Sifat Mekanik Pipa Stainless Steel 347H

Pipa Stainless Steel 347H Sifat Fisik

Kelas sing padha kanggo Pipa Stainless Steel 347H

Agregasi amiloid alpha-synuclein (αS) minangka ciri khas penyakit Parkinson lan synucleinopathies liyane.Bubar, protein tau sing umum digandhengake karo penyakit Alzheimer wis digandhengake karo patologi αS lan ditemokake bebarengan karo inklusi sing sugih αS, sanajan mekanisme molekuler koagregasi saka loro protein kasebut tetep ora jelas.Kita nglaporake ing kene yen fase αS dipisahake dadi kondensat cair liwat kondensasi kompleks elektrostatik kanthi polipeptida sing diisi positif kayata tau.Gumantung saka afinitas αS kanggo polikasi lan tingkat penipisan valensi saka jaringan koagulasi, gumpalan ngalami gelation utawa coalescence kanthi cepet, diikuti karo agregasi amiloid sing alon.Kanthi nggabungake teknik biofisika canggih, kita bisa nemtokake pemisahan fase αS/Tau cair-cair lan ngenali faktor-faktor kunci sing nyebabake pembentukan agregat heterogen sing ngemot loro protein ing kondensat protein cair.
Saliyane kompartemen membran, pemisahan spasial ing sel uga bisa digayuh kanthi pembentukan badan padhet kaya protein, kaya cairan sing disebut kondensat biomolekul utawa tetesan, liwat proses sing dikenal minangka pemisahan fase cair-cair (LLPS).Tetesan kasebut dibentuk kanthi interaksi temporal multivalent, biasane antarane protein utawa protein lan RNA, lan nglayani macem-macem fungsi ing meh kabeh sistem urip.Sebagéyan gedhé protèin sing nduweni kemampuan LLP nampilake urutan kerumitan sing sithik sing ora teratur banget lan ing pambentukan kondensat biomolekul3,4,5.Kathah studi eksperimen ingkang ngandharaken sifat fleksibel, asring boten teratur, lan multivalen saking protèin ingkang mbentuk kondensat ingkang kados cairan punika, senajan namung sekedhik ingkang dipunmangertosi babagan determinan molekuler spesifik ingkang ngontrol wutah lan mateng kondensat kasebut dados langkung padhet. negara..
Data anyar ndhukung hipotesis manawa LLPS sing didorong protein aberrant lan transformasi tetesan dadi struktur padhet bisa dadi jalur seluler sing relevan sing nyebabake pembentukan agregat beracun sing ora larut sing asring dadi ciri penyakit degeneratif.Akeh protein intrinsically disordered (IDPs) sing ana gandhengane karo LLPS, asring diisi lan fleksibel, wis suwe digandhengake karo neurodegenerasi liwat proses agregasi amiloid.Utamane, kondensat IDP biomolekul kayata FUS7 utawa TDP-438 utawa protein kanthi domain kerumitan cilik sing gedhe kayata hnRNPA19 wis dituduhake umure dadi bentuk kaya gel utawa malah padhet liwat proses sing diarani fluidisasi.majemuk.kanggo transisi fase padhet (LSPT) minangka fungsi wektu utawa nanggepi modifikasi pasca-translasi tartamtu utawa mutasi sing signifikan sacara patologis1,7.
IDP liyane sing digandhengake karo LLPS ing vivo yaiku Tau, protein kelainan sing ana gandhengane karo microtubule sing agregasi amiloid wis kena ing penyakit Alzheimer10 nanging uga bubar kena penyakit Parkinson (PD) lan proteinopati nuklir sinaptik liyane 11, 12, 13 ana hubungane.Tau wis ditampilake spontan dissociate saka solusi / sitoplasma amarga interaksi elektrostatik sarujuk14, asil ing tatanan tetesan tau-enriched dikenal minangka coacervates elektrostatik.Uga wis diamati manawa jinis interaksi non-spesifik iki minangka daya pendorong ing akeh kondensat biomolekul ing alam15.Ing kasus protein tau, agregasi elektrostatik bisa dibentuk kanthi agregasi sing prasaja, ing ngendi wilayah protein sing muatane berlawanan nyebabake proses pembelahan, utawa kanthi agregasi kompleks liwat interaksi karo polimer sing muatane negatif kayata RNA.
Bubar, α-synuclein (αS), sawijining amiloid IDP sing ana ing PD lan penyakit neurodegeneratif liyane sing dikenal minangka synucleinopathy17,18, wis dituduhake ing model seluler lan kewan19,20 sing konsentrasi ing kondensat protein kanthi prilaku kaya cairan.Panliten in vitro nuduhake yen αS ngalami LLPS kanthi agregasi sing prasaja liwat interaksi hidrofobik sing umume, sanajan proses iki mbutuhake konsentrasi protein sing dhuwur banget lan wektu inkubasi sing dawa banget19,21.Apa kondensat sing ngemot αS sing diamati ing vivo dibentuk dening proses iki utawa proses LLPS liyane, tetep dadi masalah sing ora bisa dirampungake.Kajaba iku, sanajan agregasi amiloid αS wis diamati ing neuron ing PD lan synucleinopathies liyane, mekanisme sing tepat kanggo αS ngalami agregasi amiloid intraselular tetep ora jelas, amarga overexpression saka protein iki ora katon nyebabake proses iki dhewe.Kerusakan seluler tambahan asring dibutuhake, sing nuduhake yen lokasi seluler tartamtu utawa lingkungan mikro dibutuhake kanggo renukleasi rakitan amiloid αS intraselular.Salah siji lingkungan seluler sing rawan banget kanggo agregasi bisa dadi interior kondensat protein 23 .
Sing nggumunake, αS lan tau ditemokake minangka lokalisasi ing inklusi penyakit karakteristik ing manungsa kanthi penyakit Parkinson lan synucleinopathies liyane 24,25 lan eksperimen wis nglaporake hubungan patologis sinergis antarane loro protein 26,27 sing nuduhake hubungan potensial antarane agregasi αS lan tau ing penyakit neurodegenerative.penyakit.αS lan tau wis ditemokake kanggo sesambungan lan ningkatake agregasi saben liyane ing vitro lan in vivo 28,29 lan agregat heterogen sing kasusun saka rong protein kasebut wis diamati ing otak pasien sing duwe synucleinopathies 30.Nanging, ora pati ngerti babagan basis molekul interaksi antara αS lan tau lan mekanisme ko-aggregasi.αS wis kacarita bisa sesambungan karo tau liwat daya tarik elektrostatik ing antarane wilayah terminal C sing bermuatan negatif banget ing αS lan wilayah tau sing sugih prolin tengah, sing uga diperkaya ing residu sing diisi positif.
Ing panliten iki, kita nuduhake yen αS pancen bisa dissociate dadi tetesan liwat kondensasi kompleks elektrostatik ing ngarsane protein tau, beda karo interaksi karo polipeptida muatan positif liyane kayata poli-L-lisin (pLK), lan ing proses iki.αS tumindak minangka molekul scaffold kanggo jaringan droplet.Kita wis nemtokake beda sing katon ing proses mateng coacervates αS elektrostatik, sing ana gandhengane karo bedane valensi lan kekuatan interaksi protein sing ana ing jaringan coacervate.Apike, kita mirsani co-agregasi protein αS lan tau amyloid ing coacervates Cairan long-urip lan ngenali sawetara faktor kunci sing ndadékaké kanggo co-aggregation saka loro protein ing coacervates kuwi.Ing kene kita njlèntrèhaké kanthi rinci proses iki, sing bisa dadi mekanisme molekuler sing ndasari colocalization saka rong protein ing inklusi khusus penyakit.
αS nduweni buntut C-terminal anionik ing pH netral (Gambar 1a), lan kita hipotesis yen bisa ngalami LLPS liwat kondensasi kompleks elektrostatik kanthi molekul polipeptida kelainan polikasi.Kita nggunakake 100-residu poly-L-lysine (pLK) minangka molekul model wiwitan amarga sifat polimer sing diisi positif lan ora teratur ing pH netral 32. Kaping pisanan, kita dikonfirmasi manawa pLK berinteraksi karo domain Ct saka αS liwat spektroskopi Solution NMR. (Gambar 1b) nggunakake αS berlabel 13C/15N ing ngarsane nambah rasio molar αS:pLK.Interaksi pLK karo domain Ct saka αS diwujudake kanthi gangguan saka pergeseran kimia lan nyuda intensitas puncak ing wilayah protein kasebut.Sing nggumunake, nalika kita nyampur αS karo pLK kanthi konsentrasi αS kira-kira.5–25 µM ing ngarsane polietilen glikol (5–15% PEG-8) (buffer LLPS khas: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) kita langsung ngliwati lapangan pembentukan protein sing amba. .tetesan diamati nggunakake mikroskop fluoresensi (WF) lan lapangan padhang (BF) (Fig. 1c).Tetesan 1-5 µm sing ngemot αS pekat (ditambahake 1 µM AlexaFluor488-label αS, AF488-αS), sifat elektrostatike bisa diturunake saka resistensi 10% 1,6-heksanediol (1,6-HD) lan sensitivitas kanggo paningkatan konsentrasi NaCl (Gambar 1c).Sifat kaya cairan saka coacervates kompleks elektrostatik αS / pLK dituduhake kanthi kemampuan kanggo nggabung ing milidetik (Gambar 1d).Nggunakake turbidimetry, kita ngitung tatanan tetesan ing kondisi kasebut, dikonfirmasi sifat elektrostatik saka interaksi utama sing digandhengake karo stabilitas (Gambar 1e), lan ngevaluasi efek saka macem-macem rasio polimer ing proses LLPS (Fig. 1f).Senajan tatanan tetesan diamati liwat sawetara sudhut rasio polimer, proses banget sarujuk nalika pLK luwih saka αS.LLP uga wis diamati nggunakake agen displacing kimia beda dextran-70 (70 kDa) utawa nggunakake macem-macem format sampel, kalebu kaca geser irungnya, microplate Wells saka macem-macem bahan, Eppendorf utawa kapiler kuarsa.
Perwakilan skematis saka macem-macem wilayah protein ing varian WT-αS lan ΔCt-αS sing digunakake ing panliten iki.Domain N-terminal amphipathic, wilayah hydrophobic amyloid-forming (NAC), lan domain C-terminal sing muatan negatif ditampilake kanthi warna biru, oranye, lan abang.Peta Net Charge Per Residual (NCPR) saka WT-αS ditampilake.b analisis NMR saka interaksi αS / pLK tanpa anané rumpun makromolekul.Nalika konsentrasi pLK mundhak (αS:pLK molar rasio 1:0.5, 1:1.5, lan 1:10 ditampilake ing ijo cahya, ijo, lan ijo peteng, mungguh).c Coacervate αS/pLK (rasio molar 1:10) ing 25 µM (1 µM AF488-label αS utawa pLK labeled Atto647N kanggo pencitraan WF) ing buffer LLPS (ndhuwur) utawa ditambah karo 500 mM NaCl (kiwa ngisor) utawa sawise 10 % 1,6-heksanediol (1,6-HD; tengen ngisor).Skala bar = 20 µm.d Gambar mikroskopis perwakilan saka fusi tetesan BF saka αS / pLK (rasio molar 1:10) kanthi konsentrasi 25 μM;panah nuduhake gabungan saka irungnya individu (panah abang lan kuning) menyang gulung anyar (panah oranye) ing 200 ms).Skala bar = 20 µm.e Panyebaran cahya (ing 350 nm) agregasi αS/pLK ing buffer LLPS sadurunge lan sawise ditambahake 500 mM NaCl utawa 10% 1,6-HD ing 25 µM αS (N = 3 replika sampel, rata-rata lan simpangan baku uga dituduhake).f Gambar BF (ndhuwur) lan analisis scattering cahya (ing 350 nm, ngisor) saka agregasi αS / pLK ing 25 μM αS kanthi nambah rasio molar αS: pLK (N = 3 replika sampel, rata-rata lan standar deviasi uga dituduhake).Skala bar = 10 µm.Bar skala ing siji gambar nuduhake ukuran kabeh gambar ing siji panel.Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.
Adhedhasar pengamatan kita babagan kondensasi kompleks elektrostatik αS / pLK lan pengamatan sadurunge αS minangka molekul klien kondensat tau / RNA liwat interaksi langsung karo tau31, kita hipotesis yen αS lan tau bisa misahake karo pelarut tanpa ana RNA. kondensasi.liwat komplek elektrostatik, lan αS minangka protein scaffold ing coacervates αS/Tau (pirsani distribusi muatan tau ing Gambar 2e).Kita mirsani yen nalika 10 μM αS lan 10 μM Tau441 (ngemot 1 μM AF488-αS lan 1 μM Atto647N-Tau, masing-masing) dicampur bebarengan ing buffer LLPS, kanthi gampang mbentuk agregat protein sing ngemot loro protein, kaya sing dideleng dening mikroskop WF.(Gambar 2a).Kolokalisasi saka rong protein ing tetesan dikonfirmasi kanthi mikroskop confocal (CF) (Tambahan Gambar 1a).Prilaku sing padha diamati nalika dextran-70 digunakake minangka agen agregasi (Tambahan Gambar 1c).Nggunakake salah siji PEG utawa dextran sing dilabel FITC, kita nemokake manawa agen crowding kasebut disebarake kanthi rata ing sampel, ora nuduhake segregasi utawa asosiasi (Tambahan Gambar 1d).Nanging, iku nuduhake yen ing sistem iki padha ningkataké pamisahan phase liwat efek crowding macromolecular, amarga PEG minangka agen crowding preferentially stabil, kaya sing katon ing sistem LLP liyane33,34.Tetesan kaya protein iki sensitif marang NaCl (1 M) nanging ora kanggo 1,6-HD (10% v / v), ngonfirmasi sifat elektrostatik (Tambahan Gambar 2a, b).Prilaku cairan kasebut dikonfirmasi kanthi ngamati acara tetesan gabungan milidetik nggunakake mikroskop BF (Gambar 2b).
gambar mikroskop Confocal (CF) saka αS / Tau441 coacervates ing buffer LLPS (10 μM saben protein, 0.5 μM saka AF488-label αS lan Atto647N-label Tau441).b Representative differential interference contrast (DIC) gambar saka αS / Tau441 droplet fusion (10 μM kanggo saben protein).c Diagram fase adhedhasar panyebaran cahya (ing 350 nm) saka Tau441 LLPS (0–15 µM) tanpa ana (kiwa) utawa ana (tengen) 50 µM αS.Werna sing luwih anget nuduhake luwih akeh nyebar.d Panyebaran cahya saka sampel αS / Tau441 LLPS kanthi nambah konsentrasi αS (Tau441 ing 5 µM, N = 2-3 repetisi sampel kaya sing dituduhake).e Representasi skematis saka sawetara varian protein tau lan macem-macem wilayah protein sing digunakake ing panliten iki: domain N-terminal muatan negatif (abang), wilayah sing sugih prolin (biru), domain pengikat mikrotubule (MTBD, disorot ing oranye), lan pasangan spiral pembentuk amiloid.wilayah filamen (PHF) dumunung ing MTBD (abu-abu).Peta Net Charge Per Residue (NCPR) Tau441 ditampilake.f Nggunakake 1 µM AF488-label αS lan Atto647N-labeled ΔNt-, nggunakake 1 µM AF488-labeled αS utawa ΔCt-αS ing ngarsane ΔNt-Tau (ndhuwur, 10 µM saben protein) utawa K18 (ngisor, 50 µM ) ) ) micrographs saka WF condensed ing LLPS utawa K18 buffer.Bar skala ing siji gambar nggambarake skala kabeh gambar ing siji panel (20 µm kanggo panel a, b lan f).Data mentah kanggo panel c lan d diwenehake minangka file data mentah.
Kanggo nguji peran αS ing proses LLPS iki, kita pisanan nyelidiki efek αS ing stabilitas tetesan kanthi nephelometry nggunakake nambah konsentrasi NaCl (Gambar 2c).Sing luwih dhuwur konsentrasi uyah ing conto sing ngemot αS, luwih dhuwur nilai panyebaran cahya (ing 350 nm), sing nuduhake peran stabilisasi αS ing sistem LLPS iki.Efek sing padha bisa diamati kanthi nambah konsentrasi αS (lan mulane rasio αS:Tau441) nganti kira-kira.Peningkatan 10 kali lipat relatif terhadap konsentrasi tau (5 µM) (Gambar 2d).Kanggo nduduhake yen αS minangka protein scaffold ing coacervates, kita mutusake kanggo nyelidiki prilaku mutan Tau sing diganggu LLPS, sing ora duwe wilayah terminal N sing bermuatan negatif (residu 1-150, deleng Fig. 2e) sing diarani ΔNt-Tau.Mikroskopi lan nephelometry WF dikonfirmasi manawa ΔNt-Tau dhewe ora ngalami LLPS (Gambar 2f lan Gambar Tambahan 2d), kaya sing dilaporake sadurunge 14. Nanging, nalika αS ditambahake ing solusi dispersi saka varian Tau sing dipotong iki, proses LLPS rampung rampung. dibalekake kanthi kapadhetan tetesan cedhak karo kapadhetan tetesan saka solusi ukuran lengkap Tau lan αS ing kahanan lan konsentrasi protein sing padha.Proses iki uga bisa diamati ing kondisi crowding macromolecular kurang (Tambahan Gambar. 2c).Peranan wilayah C-terminal αS, nanging ora kabeh dawa, ing proses LLPS dituduhake kanthi nyegah pembentukan tetesan nggunakake varian C-terminal truncated αS sing ora duwe residu 104-140 (Fig. 1a) saka (ΔCt- αS) protein (Gambar 2f lan Gambar Tambahan 2d).Kolokalisasi αS lan ΔNt-Tau dikonfirmasi kanthi mikroskop fluoresensi confocal (Tambahan Gambar 1b).
Kanggo luwih nguji mekanisme LLPS antarane Tau441 lan αS, varian Tau tambahan digunakake, yaiku fragmen helical filament core (PHF) pasangan ing domain microtubule-binding (MTBD), sing yen ngemot papat domain ulang karakteristik, sing umum uga dikenal. minangka fragmen K18 (pirsani Fig. 2e).Saiki wis dilapurake yen αS luwih seneng ngiket protein tau sing ana ing domain sing sugih prolin ing urutan sing sadurunge domain microtubule-binding.Nanging, wilayah PHF uga sugih ing residu sing diisi positif (pirsani Gambar 2e), utamane lisin (15% residu), sing nyebabake kita nyoba apa wilayah iki uga nyumbang kanggo kondensasi kompleks αS / Tau.Kita mirsani yen K18 mung ora bisa micu LLPS ing konsentrasi nganti 100 μM ing kondisi sing diuji (LLPS buffer kanthi 15% PEG utawa 20% dextran) (Gambar 2f).Nanging, nalika ditambahake 50 µM αS nganti 50 µM K18, pembentukan tetesan protein kanthi cepet sing ngemot K18 lan αS diamati dening nephelometry (Gambar Tambahan 2d) lan mikroskop WF (Gambar 2f).Kaya sing dikarepake, ΔCt-αS ora bisa mulihake prilaku LLPS K18 (Gambar 2f).Kita nyathet yen agregasi αS / K18 mbutuhake konsentrasi protein sing rada dhuwur kanggo ngindhuksi LLPS dibandhingake karo αS / ΔNt-Tau utawa αS / Tau441, liyane padha.Iki konsisten karo interaksi sing luwih kuat saka wilayah terminal αS C karo domain Tau sing sugih prolin dibandhingake karo domain microtubule-binding, kaya sing diterangake sadurunge 31.
Amarga ΔNt-Tau ora bisa nindakake LLPS tanpa ana αS, kita milih varian Tau iki minangka model kanggo menehi ciri αS / Tau LLPS amarga kesederhanaan ing sistem LLPS kanthi Tau lengkap (isotype, Tau441 / Tau441).kanthi proses agregasi kompleks (heterotipik, αS/Tau441).Kita mbandhingake derajat agregasi αS (minangka bagéan saka protein fase terkondensasi, fαS, c) ing sistem αS / Tau lan αS / ΔNt-Tau kanthi sentrifugasi lan analisis SDS-PAGE fase dispersed (pirsani 2e), nemokake nilai sing padha. kanggo kabeh protein ing konsentrasi sing padha.Utamane, kita entuk fαS, c 84 ± 2% lan 79 ± 7% kanggo αS / Tau lan αS / ΔNt-Tau, sing nuduhake yen interaksi heterotipik antarane αS lan tau luwih unggul tinimbang interaksi antarane molekul tau.antarane.
Interaksi karo macem-macem polikasi lan efek saka proses kondensasi ing kinetika αS pisanan diteliti kanthi cara pemulihan fluoresensi sawise photobleaching (FRAP).Kita nguji coacervates αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau lan αS / pLK (100 μM αS ditambah karo 2 μM αS AF488-αS lan 100 μM Tau441 utawa ΔNt-Tau utawa 1 mM pLK).Data dipikolehi sajrone 30 menit pisanan sawise nyampur komponen sampel.Saka gambar FRAP perwakilan (Gambar 3a, kondensasi αS / Tau441) lan kurva wektu sing cocog (Gambar 3b, Gambar Tambahan 3), bisa dideleng yen kinetika αS meh padha karo coacervates Tau441.lan ΔNt-Tau, sing luwih cepet karo pLK.Koefisien difusi sing diwilang kanggo αS nang coacervate miturut FRAP (kaya sing diterangake dening Kang et al. 35) yaiku D = 0,013 ± 0,009 µm2/s lan D = 0,026 ± 0,008 µm2/s kanggo αS/TauS/s kanggo αS/TauS441 sistem αS/.pLK, Tau, lan D = 0,18 ± 0,04 µm2/s (Gambar 3c).Nanging, koefisien difusi αS ing fase dispersed sawetara urutan gedhene luwih dhuwur tinimbang kabeh fase kental, kaya sing ditemtokake dening Spektroskopi Korelasi Fluoresensi (FCS, deleng Gambar Tambahan 3) ing kondisi sing padha (buffer LLPS) nanging ora ana polycations. (D = 8 ± 4 µm2/s).Mulane, kinetika terjemahan αS dikurangi sacara signifikan ing coacervates dibandhingake karo protein ing fase dispersed amarga efek crowding molekul sing diucapake, sanajan kabeh coacervates nahan sifat kaya cairan sajrone setengah jam pisanan sawise pembentukan, beda karo fase tau.kinetika luwih cepet ing kondensat pLK.
analisis FRAP a-c dinamika αS (2% AF488-label αS) ing coacervates elektrostatik.Gambar perwakilan saka αS / Tau441 FRAP assays ing triplicate ditampilake ing (a), ngendi bunderan abang nuduhake wilayah decolorized.Skala bar yaiku 5 µm.b Kurva FRAP rata-rata lan (c) ngitung koefisien difusi (D) kanggo 5-6 (N) tetesan beda saka telung eksperimen nggunakake 100 µM αS lan konsentrasi equimolar saka Tau441 (abang) utawa ΔNt-Tau (biru) utawa pLK (ijo) ing sepuluh kaping konsentrasi LLPS.Panyimpangan standar saka kurva FRAP ditampilake ing werna sing dipengini.Kanggo mbandhingake, koefisien difusi αS ing fase dispersed ditemtokake kanthi triplicate nggunakake spektroskopi korelasi fluoresensi (FCS) (pirsani Gambar Tambahan 3 lan cara kanggo informasi luwih lengkap).d Spektrum EPR X-band terus-terusan saka 100 μM TEMPOL-122-αS ing buffer LLPS tanpa polikasi (ireng) utawa ing ngarsane 100 μM Tau441 (abang) utawa ΔNt-Tau (biru) utawa 1 mM pLK (ijo).Ing inset nuduhake tampilan magnified saka garis lapangan kuwat ngendi owah-owahan paling serem kedaden.Kurva pengikat 50 μM TEMPOL-122-αS kanthi macem-macem polikasi tanpa ana LLPS (ora ana PEG).Amplitudo suda pita III dibandhingake karo pita II (IIII/III) saka spektrum EPR sing dinormalisasi dituduhake nambah rasio molar Tau441 (abang), ΔNt-Tau (biru) lan pLK (ijo).Garis colored nuduhake pas kanggo data nggunakake model naleni atos karo n situs naleni podho rupo lan sawijining ing saben kurva.Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.
Minangka pelengkap, kita nyelidiki dinamika αS ing macem-macem coacervates nggunakake labeling spin terarah (SDSL) lan resonansi paramagnetik elektron kontinu (CW-EPR).Cara iki wis bukti banget migunani kanggo nglaporake keluwesan lan dinamika IDP kanthi resolusi residual sing nyata36,37,38.Kanggo tujuan iki, kita mbangun residu sistein ing mutan Cys tunggal lan nggunakake probe spin 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Derivatif Maleimide menehi label.Luwih khusus, kita masang probe TEMPOL ing posisi 122 utawa 24 αS (TEMPOL-122-αS lan TEMPOL-24-αS).Ing kasus sing sepisanan, kita target wilayah C-terminal protein, sing melu interaksi karo polikasi.Nanging, posisi 24 bisa menehi informasi babagan dinamika sakabèhé protein ing kondensat.Ing loro kasus kasebut, sinyal EPR sing dipikolehi kanggo protein saka fase dispersed cocog karo radikal nitroksida ing negara obah cepet.Sawise pamisahan fase ing ngarsane tau utawa pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 utawa ΔNt-Tau kanthi rasio 1: 1 utawa pLK kanthi rasio 1:10), paningkatan intensitas puncak relatif diamati ing spektrum EPR saka αS.Garis mundhut nyebar, nuduhake kinetika reorientasi αS suda ing tetesan dibandhingake karo protein ing fase encer (Gambar 3d, Gambar Tambahan 4a).Owah-owahan kasebut luwih cetha ing posisi 122. Nalika ing posisi 24 anané pLK ora mengaruhi kinetika probe, ing posisi 122 wangun garis spektral diganti sacara signifikan (Tambahan Gambar 4a).Nalika kita nyoba model spektrum ing posisi 122 saka rong sistem αS / polycation nggunakake model isotropic (Tambahan Gambar 5a) umum digunakake kanggo njlèntrèhaké dinamika spin-labeled IDP38,39, kita ora bisa kanggo mbangun maneh spektrum eksperimen..simulasi spektral posisi 24 muter kontras (Tambahan Fig. 5a).Iki nuduhake yen ana posisi preferensial ing spasi konfigurasi spin saka wilayah C-terminal αS ing ngarsane polycations.Nalika nimbang fraksi αS ing fase kondensasi ing kahanan EPR eksperimen (84 ± 2%, 79 ± 7%, lan 47 ± 4% kanggo αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, lan αS / pLK, masing-masing-pirsani Tambahan. Fig. 2e analisis data c), bisa dideleng manawa broadening sing dideteksi kanthi metode EPR utamane nggambarake interaksi wilayah terminal C αS karo macem-macem polikasi ing fase kondensasi (owah-owahan utama nalika nggunakake TEMPOL-122- αS), lan dudu kondensasi protein.Tambah ing microviscosity diamati ing probe.Kaya sing dikarepake, spektrum EPR saka protein ing kahanan liyane saka LLPS dibalekake kanthi lengkap nalika 1 M NaCl ditambahake ing campuran (Tambahan Gambar 4b).Sakabèhé, data kita nyaranake manawa owah-owahan sing dideteksi dening CW-EPR utamane nggambarake interaksi wilayah terminal C αS karo macem-macem polikasi ing fase kondensasi, lan interaksi iki katon luwih kuat karo pLK tinimbang karo Tau.
Kanggo entuk informasi struktural liyane babagan protein ing coacervate, kita mutusake kanggo sinau sistem LLPS nggunakake NMR ing solusi.Nanging, kita mung bisa ndeteksi fraksi αS sing isih ana ing fase dispersed, sing bisa uga amarga nyuda dinamika protein ing coacervate lan fase padhet ing ngisor solusi ing analisis NMR.Nalika kita nganalisa struktur lan dinamika protein sing isih ana ing fase dispersed saka sampel LLPS nggunakake NMR (Tambahan Gambar. 5c, d), kita weruh yen protein tumindak meh padha ing ngarsane pLK lan ΔNt-Tau, loro saka sing ana ing struktur sekunder lan dinamika balung mburi protein, dicethakaké dening eksperimen babagan perpindahan kimia sekunder lan relaksasi R1ρ.Data NMR nuduhake yen C-terminus αS ngalami keluwesan konformasi sing signifikan nalika nahan sifat sing ora teratur, kaya urutan protein liyane, amarga interaksi karo polikasi.
Wiwit panyebaran sinyal CW-EPR sing diamati ing fase kondensasi TEMPOL-122-αS nggambarake interaksi protein karo polikasi, kita nindakake titrasi EPR kanggo ngevaluasi afinitas ikatan αS menyang macem-macem polikasi tanpa ana LLPS (ora ana akumulasi Buffer LLPS), nuduhake yen interaksi padha ing fase encer lan konsentrasi (sing dikonfirmasi dening data kita, Gambar Tambahan 4a lan Gambar Tambahan 6).Tujuane kanggo ndeleng apa kabeh coacervates, sanajan sifat-sifat kaya cairan sing umum, nuduhake prilaku diferensial sing ana ing tingkat molekuler.Kaya sing dikarepake, spektrum EPR nggedhekake kanthi nambah konsentrasi polikasi, nggambarake penurunan keluwesan molekul amarga interaksi molekul kabeh mitra interaksi meh nganti jenuh (Gambar 3e, Gambar Tambahan 6).pLK entuk saturasi iki kanthi rasio molar sing luwih murah (polikasi:αS) dibandhingake karo ΔNt-Tau lan Tau441.Nyatane, perbandingan data karo model ikatan kira-kira kanthi nganggep n situs ikatan sing padha lan independen nuduhake manawa konstanta disosiasi pLK (~ 5 μM) minangka urutan gedhene luwih murah tinimbang Tau441 utawa ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Sanajan iki minangka perkiraan kasar, iki nuduhake yen αS nduweni afinitas sing luwih dhuwur kanggo polikasi sing luwih prasaja kanthi wilayah muatan positif sing terus-terusan.Amarga bedane afinitas antarane αS lan macem-macem polikasi, kita duwe hipotesis manawa sifat cairan kasebut bisa beda-beda sajrone wektu lan mula ngalami proses LSPT sing beda.
Amarga lingkungan sing rame banget ing coacervate protein lan sifat amiloid saka protein, kita mirsani prilaku coacervate sajrone wektu kanggo ndeteksi kemungkinan proses LSPT.Nggunakake mikroskop BF lan CF (Gambar 4), kita mirsani yen αS / Tau441 coacervates menyang ombone gedhe ing solusi, mbentuk tetesan gedhe sing kontak lan teles lumahing ing ngisor sumur / geser minangka tetesan lengkap, kaya samesthine (Tambahan Gambar). 7d);kita nyebut iki struktur ngisor-kawangun "rakit protein".Struktur kasebut tetep cairan amarga bisa nahan kemampuan kanggo sekring (Tambahan Gambar 7b) lan bisa dideleng sawetara jam sawise LLPS dipicu (Gambar 4 lan Gambar Tambahan 7c).We diamati sing proses wetting di senengi ing lumahing hidrofilik tinimbang bahan hidrofobik (Tambahan Fig. 7a), kaya samesthine kanggo coacervates elektrostatik karo biaya ora seimbang lan kanthi mangkono dhuwur potensial lumahing elektrostatik.Utamane, coalescence αS/ΔNt-Tau lan rafting dikurangi sacara signifikan, dene kondensat αS/pLK dikurangi sacara signifikan (Gambar 4).Sajrone wektu inkubasi sing cendhak, tetesan αS / pLK bisa nggabungake lan mbasahi permukaan hidrofilik, nanging proses iki cepet mandheg lan sawise 5 jam inkubasi, mung acara coalescence winates lan ora ana wetting sing diamati.- transisi gel-tetes.
Perwakilan BF (panel abu-abu) lan CF (panel tengen, AF488-label αS ing werna ijo) saka conto coacervate ngemot 100 µM αS (1% label fluoresensi) ing buffer LLPS kanthi anané 100 µM Tau441 (ndhuwur) gambar fluoresensi) mikroskopik -Tau (tengah) utawa 1 mM pLK (ngisor) ing kaping inkubasi beda lan dhuwur fokus (z, jarak saka ngisor sumur piring).Eksperimen kasebut diulang kaping 4-6 kanthi mandiri kanthi asil sing padha.Coacervates αS/Tau441 dibasahi sawise 24 jam, mbentuk rakit sing luwih gedhe tinimbang gambar.Bar skala kanggo kabeh gambar yaiku 20 µm.
Kita banjur takon apa kolam protein kaya cairan gedhe sing dibentuk ing αS / Tau441 LLPS bakal nyebabake agregasi amiloid saka protein sing diteliti.Kita ngetutake pematangan tetesan αS / Tau441 liwat wektu kanthi mikroskop WF ing kondisi sing padha ing ndhuwur, nanging nggunakake 1 μM AF488-label αS lan Atto647N-label Tau441 (Fig. 5a).Kaya sing dikarepake, kita mirsani lokalisasi protein lengkap sajrone proses mateng.Apike, saka ca.Sawise 5 jam, struktur non-bunder sing luwih kuat diamati ing jero rakit, sing diarani "titik", sawetara sing dikolokalisasi karo αS, lan sawetara sing diperkaya ing Tau441 (Gambar 5a, panah putih).Titik-titik iki tansah diamati ing rakit kanthi luwih akeh kanggo αS/ΔNt-Tau tinimbang αS/ΔNt-Tau.Ora ana titik sing béda ing tetesan sistem pLK lan Tau sing ora kompeten kanggo fusi / wetting.Kanggo nguji manawa noda sing ngemot αS lan Tau441 minangka agregat kaya amiloid, kita nindakake eksperimen sing padha nggunakake mikroskop CF ing ngendi Tau441 dilabeli karo Atto647N lan 12.5 μM amyloid-spesifik thioflavin-T (ThT) ditambahake wiwit wiwitan.pewarna.Sanajan pewarnaan ThT saka tetesan utawa rakit αS / Tau441 ora diamati sanajan sawise 24 jam inkubasi (Gambar 5b, baris ndhuwur - tetesan sing isih ana ing rakit protein), struktur ThT-positif sing ngemot Atto647N-Tau441 ing jero rakit banget banget.iki replicates ukuran, wangun, lan lokasi panggonan diterangake sadurunge (Fig. 5b, larik tengah lan ngisor), nyaranke sing titik bisa cocog karo agregat amyloid-kaya kawangun ing coacervates adi tuwa.
WF 25 μM αS ing macem-macem kaping inkubasi lan dhuwur fokus (z, jarak saka ngisor unbound) ing ngarsane 25 μM Tau441 (1 μM AF488-label αS lan Atto647N-label Tau441) ing sumur saka piring mikroskop karo buffer LLPS) .Enem eksperimen diulang kanthi mandiri kanthi asil sing padha.b Gambar mikroskopis CF saka 25 μM αS ing ngarsane 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-label Tau441) lan 12,5 μM thioflavin-T (ThT).Tetesan protein sing ditimbang lan rakit lan bintik protein sing disimpen ditampilake ing baris ndhuwur lan tengah.Ing baris ngisor nuduhake gambar saka rakit lan irungnya saka 3 replika independen.Panah putih nuduhake titik-titik positif ThT ing loro panel kasebut.Bar skala kanggo kabeh gambar yaiku 20 µm.
Kanggo nliti luwih rinci babagan owah-owahan ing jaringan protein coacervate sajrone transisi saka cairan dadi padhet, kita nggunakake pencitraan umur fluoresensi (FLIM) lan mikroskop transfer energi resonansi Förster (FRET) (Gambar 6 lan Gambar Tambahan 8 lan 9).Kita hipotesis yen mateng coacervate saka lapisan dadi struktur protein agregat sing luwih kental utawa kaya padhet ndadékaké kontak sing luwih cedhak ing antarané protein lan probe fluoresensi sing ditempelake, duweni potensi ngasilake efek quenching sing diwujudake ing umur probe sing cendhak (τ) , kaya sing wis diterangake sadurunge40.,41,42.Kajaba iku, kanggo sampel kanthi label ganda (AF488 lan Atto647N minangka donor FRET lan pewarna akseptor, masing-masing), penurunan τ iki uga bisa diiringi kondensasi coacervate lan paningkatan efisiensi FRET(E) sajrone LSPT.Kita ngawasi formasi rakit lan titik liwat wektu ing sampel LLPS αS / Tau441 lan αS / ΔNt-Tau (25 µM saben protein ing buffer LLPS ngemot 1 µM AF488 labeled αS lan / utawa Atto647N labeled Tau441 utawa ΔNt-Tau).Kita mirsani tren umum yen umur fluoresensi saka probe AF488 (τ488) lan Atto647N (τ647N) rada mudhun nalika coacervates diwasa (Gambar 6 lan Gambar Tambahan 8c).Apike, owah-owahan iki sacara signifikan ditingkatake kanggo titik-titik ing rakit (Gambar 6c), nuduhake yen kondensasi protein luwih lanjut dumadi ing titik.Kanggo ndhukung iki, ora ana owah-owahan sing signifikan ing umur fluoresensi sing diamati kanggo tetesan αS / ΔNt-Tau sing umure 24 jam (Tambahan Gambar. 8d), nuduhake yen tetesan tetesan minangka proses sing béda saka spotting lan ora diiringi reorganisasi molekuler sing signifikan. ing coacervates.Perlu dicathet yen titik-titik kasebut nduweni ukuran sing beda-beda lan isi variabel ing αS, utamane kanggo sistem αS / Tau441 (Tambahan Gambar 8e).Penurunan umur fluoresensi titik kasebut diiringi paningkatan intensitas, utamane kanggo Atto647N sing dilabel Tau441 (Tambahan Gambar 8a), lan efisiensi FRET sing luwih dhuwur kanggo sistem αS / Tau441 lan αS / ΔNt-Tau, sing nuduhake kondensasi luwih lanjut ing LLPS Lima jam. sawise micu, protein nang listrik statis condensed.Dibandhingake karo αS / ΔNt-Tau, kita mirsani nilai τ647N sing luwih murah lan nilai τ488 sing luwih dhuwur ing titik αS / Tau441, diiringi nilai FRET sing luwih murah lan ora homogen.Bisa uga ana hubungane karo kasunyatan manawa ing sistem αS / Tau441, kelimpahan αS sing diamati lan dikarepake ing agregat luwih heterogen, asring substoikiometrik dibandhingake karo Tau, amarga Tau441 dhewe uga bisa ngalami LLPS lan agregasi (Tambahan Gambar 8e) .Nanging, derajat coalescence droplet, pembentukan rakit, lan, sing penting, agregasi protein ing coacervates kaya cairan maksimal nalika ana Tau441 lan αS.
Gambar mikroskop fluoresensi seumur hidup (FLIM) saka αS / Tau441 lan αS / ΔNt-Tau ing 25 μM saben protein (1 μM AF488-label αS lan 1 μM Atto647N-label Tau441 utawa ΔNt-Tau) ing buffer LLPS.Kolom kasebut nuduhake gambar perwakilan conto LLPS ing wektu mateng sing beda (30 min, 5 jam lan 24 jam).Pigura abang nuduhake wilayah sing ngemot titik αS/Tau441.Rentang urip ditampilake minangka bar warna.Bar skala = 20 µm kanggo kabeh gambar.b Gambar FLIM sing digedhekake ing area sing dipilih, ditampilake ing kothak abang ing panel a.Rentang urip ditampilake kanthi skala warna sing padha karo panel a.Skala bar = 5 µm.c Histogram sing nuduhake AF488 (ditempelake ing αS) utawa Atto647N (ditempelake ing Tau) kanggo macem-macem spesies protein (droplet-D-, rakit-R- lan speckle-P) sing diidentifikasi ing gambar FLIM sing direkam kanggo αS-) distribusi wektu umur Tau441 lan Sampel coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI kanggo D, 29-44 ROI kanggo R, lan 21-51 ROI kanggo poin).Nilai rata-rata lan rata-rata ditampilake minangka kothak kuning lan garis ireng ing jero kothak.Wates ngisor lan ndhuwur kothak makili kuartil pisanan lan katelu, lan nilai minimal lan maksimum ing kisaran interquartile 1,5-fold (IQR) ditampilake minangka whiskers.Outliers ditampilake minangka berlian ireng.Signifikansi statistik antarane pasangan distribusi ditemtokake nggunakake t-test rong sampel, kanthi asumsi variasi sing ora padha.Nilai-p uji-t rong buntut ditampilake kanthi tanda bintang kanggo saben pasangan data sing dibandhingake (* p-value > 0,01, ** p-value > 0,001, *** p-value > 0,0001, **** p-value> 0,00001), ns Nuduhake negligibility (p-value> 0,05).Nilai p sing tepat diwenehake ing Tabel Tambahan 1, lan data asli ditampilake minangka file data mentah.
Kanggo luwih nduduhake sifat bintik / agregat kaya amiloid, kita nambani conto coacervate sing ora diwarnai sajrone 24 jam kanthi konsentrasi NaCl (1 M) sing dhuwur, sing nyebabake pamisahan agregat saka coacervates protein.Nalika agregat terisolasi (yaiku, larutan agregat sing kasebar) diamati nggunakake mikroskop gaya atom (AFM), kita diamati morfologi sing umume bunder kanthi dhuwur biasa sekitar 15 nm, sing cenderung digandhengake ing kahanan konsentrasi uyah sing dhuwur, padha karo prilaku fibrils amyloid khas amarga efek hidrofobik kuwat ing lumahing (cathetan sing fibrils biasane duwe dhuwur saka ~ 10 nm) (Tambahan Fig. 10a).Apike, nalika agregat terisolasi diinkubasi karo ThT ing tes fluoresensi ThT standar, kita ndeleng peningkatan dramatis ing ngasilake kuantum fluoresensi ThT, dibandhingake karo sing diamati nalika pewarna diinkubasi karo fibril amiloid αS khas (Tambahan Gambar 10b), sing nuduhake yen agregat coacervate ngemot struktur kaya amiloid..Nyatane, agregat kasebut toleran karo konsentrasi uyah sing dhuwur nanging sensitif marang 4 M guanidine klorida (GdnHCl), kaya fibril amiloid sing khas (Tambahan Gambar 10c).
Sabanjure, kita nganalisa komposisi agregat nggunakake fluoresensi molekul tunggal, korelasi fluoresensi spesifik / spektroskopi korelasi silang (FCS / FCCS), lan analisis bledosan deteksi kebetulan rong warna (TCCD).Kanggo tujuan iki, kita ngisolasi agregat sing dibentuk sawise 24 jam inkubasi ing 100 μl sampel LLPS sing ngemot αS lan Tau441 (loro 25 μM) bebarengan karo 1 μM AF488-label αS lan 1 μM Atto647N-label Tau441.Ngencerake solusi agregat sing dispersed menyang negara monomolekul nggunakake buffer bebas PEG sing padha lan 1 M NaCl (buffer sing padha digunakake kanggo misahake agregat saka coacervate) kanggo nyegah interaksi elektrostatik sing bisa ditindakake antarane LLPS lan protein.Conto lintasan wektu molekul siji bisa dideleng ing Fig. 7a.Analisis FCCS / FCS (korelasi silang, CC lan autokorelasi, AC) nuduhake yen agregat sing ngemot αS lan tau akeh banget ing sampel (pirsani kurva CC ing Fig. 7b, panel kiwa), lan keluwihan protein monomerik residual muncul minangka a asil saka proses pengenceran (pirsani kurva AC ing Figure 7b, panel kiwa).Eksperimen kontrol sing ditindakake ing kondisi solusi sing padha nggunakake conto sing mung ngemot protein monomerik ora nuduhake kurva CC, lan kurva AC pas karo model difusi siji-komponen (Eq. 4), ing ngendi protein monomerik duwe koefisien difusi sing dikarepake (Gambar 7b). ), panel kanan).Koefisien difusi partikel agregat kurang saka 1 µm2/s, lan protein monomer kira-kira 1 µm2/s.50–100 µm/s;Nilai padha karo nilai sing diterbitake sadurunge kanggo sonicated αS amyloid fibrils lan monomeric αS kapisah ing kahanan solusi sing padha44.Nalika kita nganalisa agregat kanthi analisis bledosan TCCD (Fig. 7c, panel ndhuwur), kita nemokake yen ing saben agregat terisolasi (αS / Tau heteroaggregate), udakara 60% saka agregat sing dideteksi ngemot αS lan tau, udakara 30% mung ana. tau, mung 10% αS.Analisis stoikiometri saka αS / Tau heteroaggregates nuduhake yen sebagian besar heteroagregat diperkaya ing tau (stoikiometri ing ngisor 0,5, jumlah rata-rata molekul tau saben agregat 4 kali luwih akeh tinimbang molekul αS), sing konsisten karo karya kita sing diamati ing FLIM in situ. eksperimen..Analisis FRET nuduhake manawa agregat kasebut ngemot loro protein kasebut, sanajan nilai FRET sing nyata ing kasus iki ora pati penting, amarga distribusi fluorofor ing saben agregat acak amarga keluwihan protein sing ora dilabeli digunakake ing eksperimen kasebut.Apike, nalika kita nindakake analisis sing padha nggunakake 45,46 amiloid aggregation-deficient varian Tau (pirsani Gambar Tambahan 11a, b), kita weruh yen sanajan agregasi elektrostatik αS padha (Tambahan Gambar 11c, d), kemampuan kanggo mbentuk agregat ing coacervate wis suda drastis lan FLIM dideteksi sawetara panggonan ing eksperimen in situ, lan kurva salib-korélasi lemah padha diamati kanggo sampel agregat terisolasi.Nanging, kanggo jumlah cilik saka agregat sing dideteksi (mung siji sepuluh saka Tau441), kita mirsani yen saben agregat wis diperkaya ing αS tinimbang varian Tau iki, kanthi kira-kira 50% saka agregat sing dideteksi mung ngemot molekul αS, lan αS luwih heterogen. .agregat (pirsani Gambar Tambahan 11e), beda karo agregat heterogen sing digawe dening Tau441 (Gambar 6f).Asil eksperimen kasebut nuduhake yen sanajan αS dhewe bisa nglumpukake tau ing coacervate, nukleasi tau luwih disenengi ing kahanan kasebut, lan agregat kaya amiloid sing diasilake bisa tumindak minangka wujud αS lan tau.Nanging, yen inti sing sugih tau dibentuk, interaksi heterotipik antarane αS lan tau luwih disenengi ing agregat tinimbang interaksi homotipik antarane molekul tau;kita uga mirsani jaringan protein ing coacervates αS / tau cair.
a Representative fluoresensi tilak temporal saka molekul siji saka agregat terisolasi dibentuk ing αS / Tau441 coacervates elektrostatik.Semburan sing cocog karo coaggregates αS / Tau441 (bursts ing ndhuwur ambang sing dituduhake) diamati ing telung saluran deteksi (AF488 lan Atto647N emisi sawise eksitasi langsung, garis biru lan abang, Atto647N sawise eksitasi ora langsung), FRET, garis violet).b Analisis FCS/FCCS saka sampel agregat αS/Tau441 sing diisolasi saka LLPS (panel kiwa).Kurva autokorelasi (AC) kanggo AF488 lan Atto647N ditampilake kanthi warna biru lan abang, lan kurva korelasi silang (CC) sing ana gandhengane karo agregat sing ngemot loro pewarna ditampilake kanthi warna ungu.Kurva AC nggambarake anané spesies protein monomer lan agregat sing dilabeli, dene kurva CC mung nuduhake difusi agregat kanthi label ganda.Analisis sing padha, nanging ing kondisi solusi sing padha kaya ing panggonan sing terisolasi, conto sing mung ngemot monomerik αS lan Tau441 ditampilake minangka kontrol ing panel tengen.c Analisis lampu kilat fluoresensi molekul tunggal saka agregat terisolasi sing dibentuk ing coacervates elektrostatik αS/Tau441.Informasi kanggo saben agregat sing ditemokake ing papat ulangan sing beda-beda (N = 152) diplot marang stoikiometri, nilai S, lan efisiensi FRET (panel ndhuwur, garis warna nggambarake kedadeyan).Telung jinis agregat bisa dibedakake: -αS-mung agregat karo S~1 lan FRET~0, Tau-mung agregat karo S~0 lan FRET~1, lan heterogen Tau/αS agregat karo penengah S lan FRET Perkiraan jumlah saka loro protèin panandha sing dideteksi ing saben agrégat heterogen (N = 100) ditampilake ing panel ngisor (skala warna nggambarake kedadeyan).Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.
Maturasi utawa tuwa saka kondensat protein cair dadi struktur kaya gel utawa padhet liwat wektu wis dilapurake melu sawetara fungsi fisiologis kondensat47 uga ing penyakit, minangka proses ora normal sadurunge agregasi amyloid 7, 48, 49. kita sinau misahake phase lan prilaku ing rinci.LSPT αS ing ngarsane polikasi acak ing lingkungan sing dikontrol ing konsentrasi mikromolar sing kurang lan kondisi fisiologis sing relevan (cathet yen konsentrasi fisiologis sing diwilang saka αS yaiku> 1 µM50), ngetutake prilaku termodinamika khas LPS.Kita nemokake yen αS, sing ngemot wilayah C-terminal sing akeh muatan negatif ing pH fisiologis, bisa mbentuk tetesan sing sugih protein ing larutan banyu liwat LLPS kanthi anané peptida kelainan kationik banget kayata pLK utawa Tau liwat proses elektrostatik. kondensasi kompleks ing ngarsane makromolekul agregasi.Proses iki bisa uga duwe efek sing relevan ing lingkungan seluler ing ngendi αS nemoni macem-macem molekul polycationic sing ana gandhengane karo agregasi sing gegandhengan karo penyakit ing vitro lan in vivo51,52,53,54.
Ing pirang-pirang panaliten, dinamika protein ing tetesan wis dianggep minangka salah sawijining faktor kunci sing nemtokake proses mateng55,56.Ing elektrostatik αS coacervates karo polycations, proses mateng ketoke gumantung saka kekuatan interaksi karo polycations, valensi, lan multiplicity saka interaksi iki.Teori keseimbangn nuduhake yen lanskap keseimbangan saka rong negara cair bakal ana tetesan gedhe sing sugih ing biopolimer sing nyurung LLPS57,58.Wutah tetesan bisa digayuh kanthi Ostwald maturation59, coalescence60 utawa konsumsi monomer bebas ing fase dispersed61.Kanggo αS lan Tau441, ΔNt-Tau utawa pLK, sebagian besar protein dikonsentrasi ing kondensat miturut kondisi sing digunakake ing panliten iki.Nanging, nalika tetesan tau ukuran lengkap nggabung kanthi cepet nalika lumahing lumahing, coalescence tetesan lan wetting angel kanggo ΔNt-Tau lan pLK, sing nuduhake mundhut sifat cair kanthi cepet ing rong sistem kasebut.Miturut analisis FLIM-FRET kita, tetesan pLK lan ΔNt-Tau umur nuduhake tingkat agregasi protein sing padha (umur fluoresensi sing padha) minangka tetesan asli, nuduhake yen jaringan protein asli ditahan, sanajan luwih kaku.
Kita nyasarake asil eksperimen ing model ing ngisor iki (Gambar 8).Tetesan sing pisanan dibentuk minangka jaringan protein tanpa ganti rugi elektrostatik, mula ana wilayah sing ora seimbang, utamane ing antarmuka tetesan, nyebabake tetesan kanthi potensial permukaan elektrostatik sing dhuwur.Kanggo ngimbangi pangisian daya (fenomena sing umum diarani penipisan valensi) lan nyuda potensial permukaan tetesan, tetesan kasebut bisa kalebu polipeptida anyar saka fase encer, ngatur maneh jaringan protein kanggo ngoptimalake interaksi muatan-muatan, lan sesambungan karo tetesan liyane.karo lumahing (wetting).Tetesan αS / pLK, amarga jaringan protein sing luwih prasaja (mung interaksi heterotipik antarane αS lan pLK) lan afinitas sing luwih gedhe kanggo interaksi protein-protein, katon bisa ngimbangi muatan kondensat kanthi luwih cepet;pancen, kita diamati kinetika protein luwih cepet ing coacervates αS / pLK wiwitane tinimbang ing αS / Tau.Sawise penipisan valensi, interaksi dadi kurang ephemeral lan tetesan kasebut ilang sifat cair lan dadi tetesan kaya gel, ora gampang kobong kanthi potensial permukaan elektrostatik sing kurang (lan mulane ora bisa udan permukaan).Beda, tetesan αS/Tau kurang efisien kanggo ngoptimalake keseimbangan muatan droplet amarga jaringan protein sing luwih kompleks (kanthi interaksi homotipik lan heterotipik) lan interaksi protein sing luwih lemah.Iki nyebabake tetesan sing nahan prilaku cairan sajrone wektu sing suwe lan nuduhake potensial permukaan elektrostatik sing dhuwur sing cenderung diminimalisir kanthi nggabungake lan tuwuh (saingga nyilikake rasio area permukaan / volume tetesan) lan kanthi mbasahi kimia permukaan hidrofilik.Iki nggawe perpustakaan protein klempakan gedhe sing nahan sifat cairan amarga interaksi tetep banget sementara amarga telusuran konstan kanggo optimasi biaya ing jaringan protein.Sing nggumunake, wangun Tau sing dipotong N-terminally, kalebu sawetara isoform62 sing kedadeyan alami, nuduhake prilaku penengah, kanthi sawetara coacervates tuwa karo αS dadi tetesan kaya gel sing tahan suwe, dene liyane ngowahi dadi kondensat cair gedhe.Dualitas iki ing mateng coacervates elektrostatik αS konsisten karo LLPS studi teoritis lan eksperimen anyar sing wis nemtokake korélasi antarane penipisan valensi lan sieving elektrostatik ing kondensat minangka kunci kanggo ngontrol ukuran kondensat lan sifat cairan.Mekanisme 58.61.
Skema iki nuduhake jalur agregasi amiloid putative kanggo αS lan Tau441 liwat LLPS lan LSPT.Kanthi tambahan wilayah sing sugih anion (abang) lan sugih kation (biru), coacervates elektrostatik αS lan tau kanthi valensi sing marem nduweni energi permukaan sing luwih murah lan mulane kurang coalescence, sing nyebabake penuaan droplet kanthi cepet.Negara gel non-agglomerated sing stabil diraih..Kahanan iki apik banget ing kasus sistem αS / pLK amarga afinitas sing luwih dhuwur lan jaringan interaksi pasangan protein sing luwih prasaja, sing ngidini transisi kaya gel sing cepet.Kosok baline, tetesan kanthi valensi sing ora nyenengake lan, mula, wilayah sing diisi protein kasedhiya kanggo interaksi, nggawe luwih gampang coacervate kanggo nggabung lan mbasahi permukaan hidrofilik supaya bisa nyuda energi permukaan sing dhuwur.Kahanan iki luwih disenengi kanggo coacervates αS/Tau441, sing nduweni jaringan kompleks multivalent sing dumadi saka interaksi Tau-Tau lan αS-Tau sing lemah.Sabanjure, coacervates sing luwih gedhe bakal luwih gampang nahan sifat kaya cairan, saéngga interaksi protein-kanggo-protein liyane bisa kedadeyan.Pungkasane, agregat heterogen amiloid sing ngemot αS lan tau dibentuk ing cairan coacervate, sing bisa uga ana gandhengane karo sing ditemokake ing badan inklusi, sing dadi ciri penyakit neurodegeneratif.
Struktur kaya cairan gedhe sing dibentuk nalika mateng αS / Tau441 kanthi lingkungan protein sing akeh banget nanging dinamis lan, kanthi luwih sithik, coacervates αS / ΔNt-Tau minangka reservoir sing cocog kanggo nukleasi agregasi protein.Kita pancen wis mirsani pambentukan agregat protein padhet ing jinis coacervates protein iki, asring ngemot αS lan tau.Kita wis nuduhake manawa heteroagregat iki stabil kanthi interaksi non-elektrostatik, bisa ngiket pewarna ThT spesifik amyloid kanthi cara sing padha karo fibril amiloid sing khas, lan pancen duwe resistensi sing padha karo macem-macem pengaruh.Agregat αS/tau sing dibentuk dening LLPS dituduhake nduweni sipat kaya amiloid.Pancen, varian diwasa Tau sing kurang ing agregasi amiloid sacara signifikan cacat ing pambentukan agregat αS heterogen kasebut ing coacervate elektrostatik cair.Pembentukan agregat αS / Tau441 diamati mung ing jero coacervates, sing nahan sifat kaya cairan, lan ora tau, yen coacervates / droplet ora tekan negara gel.Ing kasus terakhir, tambah kekuatan interaksi elektrostatik lan, minangka asil, rigidity jaringan protein nyegah rearrangements konformasi perlu protein kanggo netepake interaksi protein anyar perlu kanggo nukleasi amyloid.Nanging, iki bisa digayuh ing coacervates sing luwih fleksibel, kaya cairan, sing luwih cenderung tetep cair nalika ukurane saya tambah.
Kasunyatan bilih pambentukan agregat ing fase kondensasi luwih disenengi ing kondensat αS / Tau sing gedhe tinimbang ing tetesan cilik sing cepet gel, nyorot relevansi kanggo ngenali faktor sing ngontrol koalesensi tetesan.Mangkono, ora mung ana kecenderungan kanggo pamisahan fase, nanging ukuran kondensat kudu dikontrol kanggo fungsi sing tepat uga nyegah penyakit58,61.Asil kita uga nyorot pentinge keseimbangan antarane LLPS lan LSPT kanggo sistem αS / Tau.Nalika pembentukan tetesan bisa nglindhungi agregasi amiloid kanthi nyuda jumlah monomer protein sing kasedhiya ing kahanan jenuh, kaya sing wis diusulake ing sistem liyane63,64, fusi tetesan ing tingkat tetesan sing dhuwur bisa nyebabake agregasi protein internal liwat penyusunan ulang konformasi sing alon.jaringan protein..
Sakabèhé, data kita banget nandheske relevansi valensi kohesif lan interaksi puas / ora puas ing jaringan gulung ing konteks LSPT.Utamane, kita nuduhake manawa kondensat αS / Tau441 kanthi lengkap bisa nggabung lan nukleat kanthi efisien kanggo mbentuk heteroagregat kaya amyloid sing kalebu loro protein lan ngusulake mekanisme molekuler adhedhasar asil eksperimen kita.Co-aggregation saka rong protein ing coacervate cairan αS / Tau sing kita laporake ing kene bisa uga ana hubungane karo lokalisasi loro protein ing inklusi, sing dadi ciri khas penyakit kasebut, lan bisa uga nyumbang kanggo mangerteni hubungan antarane LLPS lan agregasi amiloid, mbukak dalan kanggo IDP sing akeh banget ing neurodegenerasi.
Monomeric WT-αS, mutan cysteine ​​​​(Q24C-αS, N122C-αS) lan varian ΔCt-αS (Δ101-140) ditulis ing E. coli lan diresiki kaya sing wis diterangake sadurunge.5 mM DTT kalebu ing kabeh langkah ing pemurnian mutan sistein αS kanggo nyegah pembentukan ikatan disulfida.Tau441 isoform (plasmid dipikolehi saka Addgene #16316), varian ΔNt-Tau (Δ1–150, dipikolehi kanthi kloning IVA kanthi primer CTTTAAGAAGGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) lan varian kultur AggDef-Tau kanthi primer 3GCTC5-Tau (1ΔTC5-Tau) thukul kanggo OD600 = 0.6-0.7 ing 37 ° C lan 180 rpm, lan ekspresi diinduksi karo IPTG kanggo 3 jam ing 37 ° C.Panen sel ing 11.500 xg suwene 15 menit ing suhu 4 °C lan cuci nganggo buffer saline sing ngemot 150 mM NaCl.Resuspensi pelet ing buffer lisis (20 ml saben 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 1000).Langkah sonication ditindakake ing es kanthi amplitudo 80% kanggo 10 pulsa (1 menit ing, 1 menit mati).Aja ngluwihi 60 ml ing siji ultrasonik.E. coli lysates digawe panas ing 95 ° C kanggo 20 menit, banjur digawe adhem ing es lan centrifuge ing 127.000 × g kanggo 40 menit.Supernatan sing diklarifikasi ditrapake menyang membran 3,5 kDa (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) lan dialisis marang 4 L buffer dialisis (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM , PMSF 0,1 mM) suwene 10 jam.Kolom pertukaran kation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) diimbangi karo buffer ekuilibrasi (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lysate disaring liwat filter PVDF 0,22 μm lan disuntikake menyang kolom kanthi laju aliran 1 ml / min.Elusi ditindakake kanthi bertahap, tau diencerake kanthi buffer elusi 15-30% (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraksi dianalisis dening SDS-PAGE, lan fraksi sing ngemot siji pita kanthi bobot molekul tau sing dikarepake dikonsentrasi nggunakake saringan centrifuge 10 kDa lan diganti karo buffer sing ngemot 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM lan DTT 2 mM kanggo konsentrasi protein pungkasan yaiku 100 μM.Solusi protein kasebut banjur dilewati saringan PVDF 0,22 μm, kanthi cepet beku lan disimpen ing -80 ° C.Protein K18 diwenehake dening Prof Alberto Boffi.Kemurnian saka preparation iki> 95% minangka dikonfirmasi dening SDS-PAGE lan MALDI-TOF/TOF.Macem-macem sistein dilabeli kanthi kimia karo AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) utawa TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).padha dikonfirmasi dening absorbance lan MALDI-TOF / TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau lan K18 diwenehi label residu sistein asli ing posisi 191 lan 322 nggunakake Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Jerman) kanthi prosedur sing padha.Biaya net saben peta residu kanggo αS lan Tau441 digawe nggunakake CIDER66.
Poly-L-lysine padhet (pLK DP 90-110 miturut NMR saka supplier, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) dibubarake ing 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 nganti 10 konsentrasi mM, proses sonicated kanggo 5 menit ing adus banyu ultrasonik lan simpen ing -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) lan FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) larut banyu lan disebarake ing buffer LLPS.Dialisis mbusak uyah sing kontaminasi.Banjur disaring liwat saringan jarum suntik kanthi ukuran pori 0,22 μm, lan konsentrasi diwilang nggunakake refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Sampel LLPS disiapake ing suhu kamar kanthi urutan ing ngisor iki: buffer lan ekstrusi dicampur lan 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etana- 1, 2-diyldinitrile) asam tetraacetic (EDTA, carboxynth) lan campuran 1% inhibitor protease (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Banjur αS lan polikasi gabungan (opsi pLK utawa Tau) ditambahake.Kanggo eksperimen time series thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), gunakake konsentrasi ThT total dadi setengah konsentrasi αS.Alon-alon nanging sak tenane nyampur conto kanggo mesthekake padha homogen.Konsentrasi saben komponen beda-beda saka eksperimen nganti eksperimen, kaya sing diterangake ing bagean Asil.Azide digunakake kanthi konsentrasi 0,02% (w/v) nalika wektu eksperimen ngluwihi 4 jam.Kanggo kabeh analisis nggunakake conto LLPS, ngidini campuran kanggo equilibrate kanggo 5 menit sadurunge analisis.Kanggo analisis hamburan cahya, 150 µl sampel dimuat ing microplates 96-sumur sing ora ngiket (µClear®, ireng, Sumur F-Bottom/Chimney, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) lan ditutupi film adesif.LLP dipantau kanthi ngukur absorbansi ing 350 nm ing tengah solusi ing maca piring CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman).Eksperimen ditindakake kanthi rangkep kaping telu ing suhu 25 ° C, lan kesalahan diitung minangka standar deviasi saka rata-rata.Fase dilute diukur kanthi sentrifugasi sampel lan analisis gel SDS-PAGE, lan fraksi αS ing fase encer lan konsentrasi diukur ing macem-macem solusi LLPS.Sampel LLPS 100 μl sing ngemot 1 μM AF488-label αS disiapake kanthi nyampur kanthi lengkap banjur sentrifugasi ing 9600 × g suwene 30 menit, sawise endapan kasebut biasane katon.50 μl ndhuwur supernatan digunakake kanggo kuantifikasi protein nggunakake gel SDS-PAGE.Gel dipindai nganggo saringan AF488 nggunakake sistem pencitraan gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) utawa diwarnai nganggo pewarnaan Coomassie lan digambarake nganggo saringan sing cocog.Pita sing diasilake dianalisis nggunakake ImageJ versi 1.53i (National Institutes of Health, USA).Eksperimen kasebut ditindakake kanthi duplikat ing rong eksperimen beda kanthi asil sing padha.
Biasane, 150 μl sampel ditrapake kanggo mikroplate 96-sumur sing ora naleni lan digambarake ing suhu kamar ing mikroskop terbalik Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman).Kanggo eksperimen titik, piring µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman) utawa microplate polystyrene 96-well (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) uga digunakake.EL6000 halogen utawa lampu halida logam merkuri digunakake minangka sumber iluminasi (kanggo BF / DIC lan WF imaging, mungguh).Kanggo mikroskop WF, objektif udara pembesaran 40x (Leica Microsystems, Jerman) digunakake kanggo fokus cahya ing sampel lan ngumpulake.Kanggo conto label AF488 lan ThT, saringan eksitasi lan emisi kanthi set filter GFP standar, saringan bandpass eksitasi lan emisi, saringan bandpass 460–500 nm lan 512–542 nm, lan pangilon dichroic 495 nm.Kanggo conto sing dilabeli karo Atto647N, set standar saringan Cy5 kanthi saringan bandpass eksitasi lan emisi 628-40 nm lan 692-40 nm, lan pangilon dichroic 660 nm digunakake.Kanggo mikroskop BF lan DIC, gunakake tujuan koleksi cahya sing padha.Cahya sing diklumpukake direkam ing kamera Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Jerman).Wektu cahya yaiku 50 ms kanggo pencitraan mikroskop BF lan DIC lan 20-100 ms kanggo pencitraan mikroskop WF.Kanggo mbandhingake, wektu cahya kanggo kabeh eksperimen karo ThT yaiku 100 ms.Eksperimen time-lapse ditindakake kanggo nggambarake coalescence droplet, kanthi gambar diklumpukake saben 100 ms sajrone sawetara menit.ImageJ (NIH, USA) digunakake kanggo analisis gambar.Eksperimen kasebut ditindakake kanthi rapet kanthi asil sing padha.
Kanggo eksperimen kolokalisasi, rekonstruksi FRAP lan 3D, gambar dipikolehi ing mikroskop confocal terbalik Zeiss LSM 880 nggunakake edisi biru ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jerman).Sampel 50 µl ditrapake kanggo piring µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Jerman), diolah nganggo polimer hidrofilik (ibiTreat) lan dipasang ing 63 × tujuan kecemplung minyak (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) ing DIC).Gambar dipikolehi nggunakake garis laser argon 458 nm, 488 nm, lan 633 nm kanthi resolusi 0.26 µm / piksel lan wektu cahya 8 µs / piksel kanggo jendhela deteksi eksitasi lan emisi 470-600 nm, 493-628 nm, lan 638-755 nm digunakake kanggo nggambarake ThT, AF488 lan Atto647N.Kanggo eksperimen FRAP, fotografi selang wektu saben sampel direkam ing 1 pigura per detik.Eksperimen kasebut ditindakake kanthi rapet ing suhu kamar kanthi asil sing padha.Kabeh gambar dianalisis nggunakake piranti lunak edisi biru Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jerman).Kurva FRAP dinormalisasi, diplot lan dipasang menyang data intensitas / wektu sing diekstrak saka gambar nggunakake Zen 2 nggunakake OriginPro 9.1.Kurva pemulihan dipasang ing model mono-eksponensial kanggo nyathet difusi molekuler kanthi istilah eksponensial tambahan kanggo nyathet efek bleaching akuisisi.Kita banjur ngetung D nggunakake radius bleaching nominal lan setengah urip Recovery sadurunge ditemtokake minangka ing persamaan Kang et al.5 35 ditampilake.
Varian sistein tunggal αS disintesis karo 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ing posisi 24 (TEMPOL-24-αS) lan 122 (TEMPOL-122-αS), mungguh.Spin Labeling Kanggo eksperimen EPR, konsentrasi αS disetel ing 100 μM lan konsentrasi PEG yaiku 15% (w / v).Kanggo macem-macem kondisi agregasi, rasio αS:pLK yaiku 1:10, dene rasio αS:ΔNt-Tau lan αS:Tau441 dipertahankan ing 1:1.Kanggo eksperimen titrasi ikatan tanpa ana crowding, TEMPOL-122-αS dipertahankan ing 50 μM lan polycations dititrasi kanthi nambah konsentrasi, nyiapake saben kondisi kanthi kapisah.Pangukuran CW-EPR ditindakake kanthi nggunakake spektrometer Bruker ELEXSYS E580 X-band sing dilengkapi resonator Bruker ER4118 SPT-N1 kanthi frekuensi gelombang mikro (SHF) ~ 9,7 GHz.Suhu disetel ing 25 ° C lan dikontrol dening cryostat nitrogen cair.Spektrum dipikolehi ing kahanan ora jenuh kanthi daya MW 4 mW, amplitudo modulasi 0,1 mT, lan frekuensi modulasi 100 kHz.Intensitas spektral dinormalisasi kanggo ngindhari beda ing konsentrasi spin ing antarane conto lan kemungkinan pengurangan spin amarga konsentrasi residual reduktor ing conto sing ngemot Tau441 utawa ΔNt-Tau (ana ing solusi protein asli).Nilai g diwenehi minangka asil modeling spektral EPR sing ditindakake nggunakake piranti lunak Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) sing diimplementasikake ing Matlab®67.Siji/loro komponen model isotropik digunakake kanggo model data.Sawise normalake kabeh sinyal, residual diitung kanthi nyuda saben simulasi saka spektrum eksperimen sing cocog.Kanggo analisis titrasi ikatan, intensitas relatif saka pita katelu menyang pita kapindho saka spektrum EPR normalisasi (IIII / III) digunakake kanggo ngawasi ikatan polikasi menyang αS.Kanggo ngira konstanta disosiasi (Kd), kurva sing diasilake dipasang ing model kira-kira kanthi nganggep n situs ikatan sing padha lan bebas.
Eksperimen spektroskopi NMR ditindakake kanthi nggunakake spektrometer NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) sing dilengkapi cryoprobe lan Z-gradient.Kabeh eksperimen ditindakake kanthi nggunakake 130-207 µM αS lan padha karo αS / ΔNt-Tau lan pLK ing 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 lan ditindakake ing 15 ° C.Kanggo ngawasi LPS kanthi NMR, 10% PEG ditambahake ing sampel sing wis dicampur.Plot perturbasi shift kimia (Fig. 1b) nuduhake owah-owahan kimia rata-rata 1H lan 15N.Spektrum αS 2D1H-15N HSQC ditugasake adhedhasar tugas sadurunge (entri BMRB #25227) lan dikonfirmasi kanthi ngrekam lan nganalisa spektrum 3D HNCA, HNCO lan CBCAcoNH.Pergeseran kimia 13Cα lan 13Cβ diwilang ing ngarsane ΔNt-Tau utawa pLK kanggo ngukur kemungkinan owah-owahan ing tren struktur sekunder dibandhingake karo owah-owahan kimia αS ing konformasi gulungan acak murni 68 (Tambahan Gambar 5c).Tarif R1ρ diukur kanthi ngrekam eksperimen hsqctretf3gpsi (dipikolehi saka perpustakaan Bruker) kanthi wektu tundha 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, lan 800 ms, lan fungsi eksponensial disetel menyang tundha intensitas puncak sing beda. kaping kanggo nemtokake R1ρ lan kahanan sing durung mesthi eksperimen.
Eksperimen mikroskopi fluoresensi sing wis ditanggulangi kanthi rong warna ditindakake ing mikroskop confocal fluoresensi MT200 sing ditanggulangi wektu komersial (PicoQuant, Berlin, Jerman) kanthi piranti ngitung foton tunggal (TCSPC) sing ana hubungane karo wektu.Kepala dioda laser digunakake kanggo eksitasi interleaved pulsed (PIE), sinar kasebut ngliwati pandu gelombang mode siji lan disetel menyang daya laser 10 nganti 100 nW kanggo garis laser 481 nm lan 637 nm sing diukur sawise pangilon dichroic.Iki njamin tingkat pancacahan foton sing optimal, ngindhari efek aliasing foton, photobleaching lan jenuh.μ-Slide angiogenesis coverslips utawa piring (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman) diselehake langsung ing banyu kecemplung liwat lensa Super Apochromat 60x NA 1.2 kanthi kerah korektif (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Cermin dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) digunakake minangka pemisah sinar utama.Radiasi sing ora fokus diblokir dening bolongan kanthi diameter 50 mikron, banjur radiasi fokus dipérang dadi 2 jalur deteksi kanthi pamisah sinar 50/50.Filter emisi Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 kanggo pewarna ijo (AF488) lan 690/70 kanggo pewarna abang (Atto647N) digunakake ing ngarep detektor.Single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) digunakake minangka detektor.Pangumpulan lan analisis data ditindakake nggunakake piranti lunak SymphoTime64 sing kasedhiya kanthi komersial (PicoQuant GmbH, Berlin, Jerman).
Sèket mikroliter sampel LLPS ditrapake ing sumur μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman).Gambar sing diasilake difokusake nganti 20 µm ing sadhuwure sumur kanggo jarak kerja objektif sing optimal kanggo tetesan sing digantung lan nganti ~1 µm kanggo rakit lan titik kanthi resolusi aksial paling ora 0,25 µm/piksel lan wektu tundha 400 µs/piksel.Pilih data kanthi ngetrapake ambang intensitas adhedhasar intensitas sinyal latar mburi rata-rata (PBG, rata-rata + 2σ) kanggo saben saluran supaya mung tetesan protein cair, rakit, utawa bintik-bintik sing dipilih, nyaring asal-usul saka fase sing disebar.Kanggo nganalisa umur saben spesies (τ) saben saluran (ijo, "g" kanggo AF488 lan abang, "r" kanggo Atto647N), kita milih wilayah kapentingan (ROI) sing ngemot tetesan, rakit, utawa titik (Tambahan Gambar 1). ).8b) lan diturunake kanthi nyetel bosok umure (τD, τR lan τP kanggo tetesan, rakit utawa bintik-bintik, deleng Gambar Tambahan 8c) ing saben saluran nggunakake analisis tail-fit lan model bosok rong komponen.Rata-rata τ saka τ .ROI sing ngasilake foton sithik banget kanggo pas multi-eksponensial ora kalebu saka analisis.Potongan sing digunakake yaiku <104 foton kanggo rakit lan titik lan 103 kanggo tetes.Tetesan kasebut nduweni ambang sing luwih murah amarga angel entuk kurva pembusukan kanthi nilai intensitas sing luwih dhuwur, amarga tetesan ing lapangan gambar biasane luwih cilik lan kurang akeh.ROI kanthi jumlah foton ing ndhuwur watesan akumulasi foton (diset menyang> 500 count / piksel) uga dibuwang kanggo analisis.Cocokake kurva intensitas bosok sing dipikolehi saka wilayah sing dikarepake kanthi intensitas maksimal 90% (rada sawise intensitas maksimum bosok) saka wiwitan umur layanan kanggo njamin gangguan IRF minimal nalika tetep padha kanggo kabeh bosok intensitas. setelan Relative wektu jendhela Padha analisa 25 kanggo 50 ROI kanggo rakit lan panggonan lan 15-25 ROI kanggo irungnya, gambar sing dipilih saka luwih saka 4 replika direkam saka ing paling 3 nyobi sawijining.Tes-t rong buntut wis digunakake kanggo ngevaluasi beda statistik antarane spesies utawa antarane sistem coacervate.Kanggo analisis piksel-by-piksel saka umur (τ), total atenuasi umur liwat lapangan kanggo saben saluran diitung lan kira-kira model atenuasi eksponensial 2/3-komponen ditindakake.Atenuasi umur kanggo saben piksel banjur dipasang nggunakake nilai τ sing wis diwilang sadurunge, ngasilake gambar pseudocolor FLIM fit.Rentang umur sing cocog karo buntut padha ing kabeh gambar saka saluran sing padha, lan saben bosok ngasilake foton sing cukup kanggo nyedhiyakake pas sing bisa dipercaya.Kanggo analisis FRET, piksel dipilih kanthi ngetrapake ambang intensitas kurang saka 100 foton, sing rata-rata sinyal latar mburi (FBG) saka 11 foton.Intensitas fluoresensi saben saluran didandani kanthi faktor koreksi sing ditemtokake kanthi eksperimen: 69 spektral crosstalk α yaiku 0,004, eksitasi langsung β yaiku 0,0305, efisiensi deteksi γ yaiku 0,517.Efisiensi FRET ing tingkat piksel banjur diitung nganggo persamaan ing ngisor iki:
ing ngendi FDD minangka intensitas fluoresensi sing diamati ing saluran donor (ijo), FDA minangka intensitas fluoresensi sing diamati ing saluran akseptor (abang) kanthi eksitasi ora langsung, lan FAA minangka intensitas fluoresensi sing diamati ing saluran akseptor (abang) ing eksitasi langsung ( PIE).Pulsa intensitas fluoresensi diamati ing saluran).
Selehake 100 µl larutan reaksi LLPS sing ngemot 25 µM monomerik tanpa label Tau441 (kanthi utawa tanpa 25 µM αS) ing buffer LLPS (ditambahake kaya ing ndhuwur) ing mikroplate 96 sumur sing ora ngiket kanthi lapisan foil adesif lan formasi tetesan dicenthang kanthi mikro WF. keseimbangn.ing 10 min.Sawise 48 jam inkubasi ing suhu kamar, anané rakit lan bintik protein dikonfirmasi.Banjur kanthi ati-ati mbusak cairan saka rakit saka sumur, banjur tambahake 50 L buffer disosiasi (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) lan inkubasi nganti 10 menit.Konsentrasi uyah sing dhuwur mesthekake yen LLPS ora bakal mbaleni amarga sisa PEG, lan kemungkinan rakitan protein sing mung dibentuk kanthi interaksi elektrostatik bakal dibongkar.Ing ngisor sumur kasebut kanthi ati-ati dikerok nganggo ujung mikropipet lan solusi sing diasilake ditransfer menyang sumur pengamatan kosong.Sawise inkubasi sampel kanthi 50 μM ThT sajrone 1 jam, anané bintik-bintik sing diisolasi dipriksa nganggo mikroskop WF.Siapke fibrils sonicated αS dening inkubasi 300 µl saka 70-μM solusi αS ing PBS karo pH 7,4, sodium azide 0,01% ing 37 ° C lan 200 rpm ing shaker orbital kanggo 7 dina.Solusi kasebut banjur disentrifugasi ing 9600 × g kanggo 30 menit, pelet kasebut digantung maneh ing PBS pH 7.4 lan sonicated (1 min, siklus 50%, amplitudo 80% ing sonikator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) conto fibril. kanthi distribusi ukuran sing relatif seragam saka fibril cilik.
Analisis FCS / FCCS lan deteksi kebetulan rong warna (TCCD) ditindakake ing mikroskop confocal fluoresensi MT200 sing padha (Pico-Quant, Berlin, Jerman) sing digunakake kanggo eksperimen mikroskop FLIM-FRET nggunakake mode PIE.Daya laser kanggo eksperimen iki ditambahake menyang 6.0 µW (481 nm) lan 6.2 µW (637 nm).Kombinasi kekuwatan laser iki dipilih kanggo ngasilake padhang sing padha kanggo pasangan fluorofor sing digunakake nalika entuk tingkat count optimal lan ngindhari photobleaching lan jenuh.Nglumpukake lan analisis data ditindakake nggunakake piranti lunak SymphoTime64 versi 2.3 sing kasedhiya kanthi komersial (PicoQuant, Berlin, Jerman).
Sampel agregat αS/Tau sing diisolasi sing dipikolehi nggunakake LLPS diencerake ing buffer isolasi nganti konsentrasi monomolekul sing cocog (biasane pengenceran 1:500, amarga agregat wis ana ing konsentrasi sing sithik nalika diisolasi saka conto coacervate).Sampel ditrapake langsung menyang tutup tutup (Corning, USA) sing dilapisi karo larutan BSA kanthi konsentrasi 1 mg / mL.
Kanggo analisis PIE-smFRET ing saluran ijo lan abang, ambang intensitas sing luwih murah saka 25 foton ditrapake kanggo nyaring sinyal intensitas rendah sing disebabake dening acara monomerik (cathetan yen monomer luwih akeh tinimbang conto sing dikumpulake dibandhingake karo agregat sing terisolasi).Ambang iki diitung minangka kaping lima intensitas rata-rata monomer αS sing dipikolehi saka analisis sampel monomer murni supaya bisa milih agregat kanggo analisis.Sirkuit drive PIE, bebarengan karo akuisisi data TSCPC, wis ngaktifake aplikasi saringan bobot seumur hidup sing mbantu ngilangi latar mburi lan crosstalk spektral.Intensitas suar sing dipilih kanthi nggunakake ambang ing ndhuwur didandani nggunakake sinyal latar mburi rata-rata sing ditemtokake saka histogram kedadeyan versus intensitas / tong saka sampel mung buffer.Semburan sing digandhengake karo agregat gedhe biasane ngenggoni sawetara tong sampah sing terus-terusan sajrone wektu (diset dadi 1 ms).Ing kasus kasebut, tong sampah kanthi kekuatan maksimal dipilih.Kanggo analisis FRET lan stoikiometri, faktor gamma γ (0.517) sing ditemtokake sacara teoritis digunakake.Crosstalk spektral lan kontribusi eksitasi langsung bisa diabaikan (ditemtokake kanthi eksperimen) ing daya laser eksitasi sing digunakake.Efisiensi lan stoikiometri FRET ing bledosan diitung kaya ing ngisor iki.