347 komponèn kimia tabung coiled stainless steel, Identifikasi protein pendamping leukosit manungsa antigen-A (HLA-A) responsif interferon novel nggunakake spektrometri massa silang (CLMS)

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.
Slider nuduhake telung artikel saben slide.Gunakake tombol mburi lan sabanjuré kanggo mindhah liwat minger, utawa tombol controller geser ing mburi kanggo mindhah liwat saben geser.

Deskripsi Produk

Tabung Coil Stainless Steel 347L, Kelas Baja: SS347L

Sistem sinyal interferon ngindhuksi respon sitokin sing kuat marang macem-macem sinyal patologis patogen lan intrinsik saka lingkungan, sing nyebabake induksi subset saka protein interferon-inducible.Kita nggunakake spektrometri massa cross-link-mediated DSS (CLMS) kanggo ndeteksi interaksi protein-protein anyar ing domain protein sing diakibatake interferon.Saliyane protèin interferon-inducible sing dikarepake, kita uga ngidhentifikasi tambahan intermolecular lan intramolecular cross-linked anyar saka protein interferon-inducible kanonik kayata MX1, USP18, OAS3, lan STAT1.Kita fokus ing validasi ortogonal saka set novel jaringan protein interferon-inducible sing dibentuk dening protein HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) nggunakake co-immunoprecipitation lan sinau luwih lanjut nggunakake pemodelan dinamika molekul.Pemodelan dinamika konformasi kompleks protein ngungkapake sawetara situs interaksi sing nggambarake interaksi sing diidentifikasi ing temuan CLMS.Bebarengan, kita nampilake studi pilot CLMS kanggo ngenali kompleks sinyal anyar sing disebabake dening interferon, lan ngarepake panggunaan CLMS sing luwih akeh kanggo ngenali dinamika interaksi protein anyar ing lingkungan mikro tumor.
Sadurunge respon imun adaptif diwiwiti, sistem pertahanan bawaan inang masang respon antimikroba sing ditengahi dening kulawarga sitokin alfa-heliks sing disekresi disebut interferon (IFNs).Kelas IFN tipe I IFNα lan IFNβ ngaktifake respon seluler, kalebu status antivirus, proapoptotik, proinflamasi, lan antiproliferatif.Ing manungsa, 13 subtipe IFNα dikenal, kabeh dikelompokake ing kromosom 91. Aneh, mung IFNα2 sing wis diteliti kanggo panggunaan klinis.Bubar, perhatian khusus wis dibayar kanggo riset babagan subtipe liyane saka IFNα.Panaliten anyar nuduhake yen IFNα14 minangka salah sawijining isoform sing paling efektif kanggo mbatesi replikasi HBV2 lan HIV-13,4 dibandhingake karo subtipe IFNα2 kanonik.
Wis ditetepake yen kompleks reseptor interferon tipe I sing diaktifake (IFNAR1 lan IFNAR2) micu kaskade transduksi sinyal sing ditengahi dening kinase Janus TYK2 lan JAK15,6.Iki Janus kinase phosphorylate transduser sinyal lan transcriptional protein activators (STAT1 lan STAT2) ing residu tirosin kanggo miwiti SH2 domain-mediated heterodimerization6.Sabanjure, IRF9 ngiket heterodimer STAT kanggo mbentuk kompleks trimerik saka gen faktor 3 sing dirangsang IFN (ISGF3), sing translokasi menyang nukleus lan ngindhuksi transkripsi luwih saka 2000 gen sing dirangsang interferon (ISG) 5,6,7,8.
ISG mbentuk tulang punggung sistem kekebalan bawaan, utamane kanggo nanggepi serangan virus.Minangka garis pertahanan pisanan nglawan infeksi virus, sel kanthi cepet nyebarake interaksi ekstensif protein seluler kanthi macem-macem aktivitas biologis.Protein kasebut kalebu reseptor pangenalan pola, molekul sinyal, faktor transkripsi, lan protein kanthi fungsi antivirus langsung, uga regulator negatif saka respon imun9.Kathah informasi babagan aktivitas ISG asalé saka layar fungsional kanthi nggunakake layar overexpression10,11 utawa teknik silencing gene (siRNA, RNAi lan CRISPR)12,13 ing ngendi ISG individu diekspresikan utawa dicegah lan aktivitase diuji ing macem-macem virus.Sanajan panaliten kasebut wis nemtokake sifat antivirus saka ISG individu, mekanisme molekuler sing ndasari saben ISG tetep ora dingerteni.Umume ditampa manawa akeh protein berinteraksi karo siji utawa luwih sitokin kanggo mesthekake aktivitas lengkap, mula ISG berinteraksi langsung utawa interaksi kasebut ditengahi dening protein seluler.Contone, studi proteomik photocrosslinked anyar ngidentifikasi ATPase VCP/p97 minangka mitra interaksi utama IFITM3, sing inhibisi ndadékaké cacat ing sorting lisosom, turnover, lan cotransport IFITM3 karo partikel virus 14.Nggunakake immunoprecipitation, kita ngenali VAPA, protein sing ana gandhengane karo vesikel, minangka mitra interaksi karo IFITM1 / 2/3 sing mediasi pematangan virus sing dimediasi kolesterol, lan iki dikonfirmasi dening panaliten liyane nggunakake sistem ragi loro-hibrida.Dhukungan Ilmiah 15 , 16 .
Proses biologis dhasar sing melu nyegah infeksi lan transformasi ganas yaiku presentasi antigen, sing ditengahi dening molekul kompleks histokompatibilitas utama (MHC).Peptida (asam amino 8-12 dawa) saka protèin sing dipecah, diakhiri prematur utawa salah lipatan dimuat menyang heterodimer MHC-I (kapérang saka rantai abot lan entheng MHC-I, diarani β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .Trimer MHC-I stabil sing diasilake diangkut menyang lumahing sel, ing ngendi peptida intraselular diwenehi menyang sel T CD8+ (sel T sitotoksik)17.Sèl T ngenali lan ngrusak patogen lan sel sing mawa antigen spesifik tumor.Akibate, patogen lan sel tumor asring nyuda proses presentasi antigen kanggo nyegah pengawasan imun.Kajaba iku, MHC-I wis downregulated ing 40-90% saka tumor manungsa lan asring digandhengake karo prognosis miskin19.
Gen sing melu nanggapi patogen kudu cepet ngalih ing antarane kahanan istirahat lan kahanan transkripsi aktif.Mulane, sawetara protèin selular diduga melu nanggepi panjaluk IFN sing dhuwur sajrone wektu sing cendhak, kalebu remodeling lan modifikasi promotor kromatin 20,21.Umume panaliten fokus ing identifikasi mitra protein ISG individu ing ngarsane IFN.Sawetara studi proteomik lan transkriptomik ing sistem sel model wis njlentrehake efek IFN ing lanskap seluler.Nanging, sanajan pemahaman sing akeh babagan dinamika sing disebabake dening interferon, kita isih ngerti sethithik babagan keterlibatan ISG.Nalika nimbang kerumitan lan dinamika sinyal interferon sing gumantung ing wektu, ana rong pitakonan: (i) apa bisa stabil lan njebak kompleks multiprotein sing ana ing sinyal cepet, lan (ii) bisa interaksi kasebut dipetakan menyang ruang 3D?
Kanggo ngatasi masalah kasebut, kita ngetrapake succinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) ditambah karo spektrometri massa (CLMS) kanggo nyinaoni jaringan interaksi protein sing diinduksi IFNα lan dinamika.DSS nambahake ikatan kovalen antarane residu proksimal protein lan/utawa kompleks protein ing vivo.Analisis MS sakteruse mbukak situs crosslinking tartamtu sing nggambarake jarak spasial wilayah ing protein tartamtu, sing disebut linkages internal, utawa subunit ing kompleks protein, sing diarani interrelationships.Nggunakake pendekatan iki, kita wis ngenali sawetara kompleks protein-protein novel uga jaringan interaksi multiprotein sing diakibatake interferon.Kanthi luwih nguji subset saka interaksi anyar iki, kita nduduhake manawa H2BFS (H2B histone-jinis FS; sabanjure diarani H2B) lan MDN1 tumindak minangka mitra pengikat kanggo HLA-A.
Sel Flo-1 minangka salah sawijining model in vitro adenokarsinoma esophageal sing paling misuwur amarga niru fitur utama tumor esophageal22,23.Nanging, ora kabeh tumor minangka imunogenik, lan kanggo nemtokake manawa sel Flo-1 nanggapi perawatan interferon, kita ngobati sel Flo-1 kanthi 10 ng / ml IFNα sajrone 72 jam.Sel Flo-1 nuduhake induksi awal pSTAT1 lan IRF1, diwiwiti jam 2 sawise perawatan lan terus nganti jam 72, kanthi nyuda tingkat stasioner IRF1 (Gambar 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, lan ISG15) ditemokake banget diinduksi sawise jam 6, niru respon fase pertengahan lan pungkasan klasik kanggo IFNα (Gambar 1A).Bebarengan, data kasebut nuduhake yen model seluler iki bisa digunakake kanggo nyinaoni respon interferon.
Respon ekspresi protein diferensial ing sel Flo-1 sawise perawatan IFNα.(A) Ekspresi protein ing sel Flo-1 sing diobati kanthi 10 ng / ml IFNα kanggo 2, 6, 24, 48 lan 72 jam dianalisis kanthi immunoblot nggunakake antibodi ISG sing dituduhake.(B) Coomassie blue stained SDS-PAGE gel saka kabèh ekstrak sel sawise cross-linking karo DSS kanggo wektu lan konsentrasi dituduhake.(C) Immunoblot perwakilan diteliti kanthi antibodi p53 (DO-1) saka sampel sing padha kanggo netepake derajat ikatan silang protein.
Kanggo njupuk lanskap interaksi protein in situ, kita nggunakake DSS, agen cross-linking sing akeh digunakake amarga permeabilitas membran sing dhuwur lan wektu reaksi sing relatif cendhak.Wektu reaksi sing luwih cendhek mbantu nyegah pembentukan agregat gedhe saka protèin sing disambung silang, saéngga njaga stabilitas crosslinker.Kanggo nemtokake konsentrasi DSS sing optimal lan ngindhari over-crosslinking, kita pisanan mbukak sel menyang 5, 2.5, lan 1 mM DSS kanggo 5, 10, 5, lan 30 menit, lan nganalisa lisat dening Coomassie-stained SDS-PAGE. (data ora ditampilake).Lysates sel katon banget salib ing konsentrasi paling lan ing wektu paling cendhak.Mulane, DSS dititrasi dadi 1, 0,5, lan 0,1 mM sajrone 5 menit (Gambar 1B).Crosslinking optimal diamati kanthi 0,5 mM DSS sajrone 5 menit, lan kondisi kasebut dipilih kanggo sel sing diobati karo IFNα.Kajaba iku, Figure 1C nuduhake Western blot dileksanakake nggunakake antibodi p53 (DO-1) kanggo netepke tingkat protein cross-linking.
Sel Flo-1 diobati kanthi 10 ng / ml IFNα sajrone 24 jam sadurunge nambahake crosslinker.Sel-sel sing disambung silang banjur dilisisake dening proteolisis rong langkah lan protein diproses dening FASP (Gambar 2)24,25.Peptida tryptic cross-linked dianalisis kanthi spektrometri massa (Gambar 2).Spektrum MS/MS banjur dicocogake karo urutan protein lan diukur nganggo MaxQuant26,27.Peptida sing disambung silang diidentifikasi saka spektrum sing dipikolehi nggunakake program SIM-XL, lan senyawa individu digabungake dadi jaringan kompleks nggunakake pipa piranti lunak komputasi sumber terbuka xQuest28 lan SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL ngenali interaksi protein-protein, rentengan internal lan rentengan individu ing campuran protein prasaja utawa Komplek lan menehi Tulisan kanggo visualizing interaksi ing struktur protein.Kajaba iku, rangking saben referensi silang minangka skor ID miturut kualitas spektrum MS / MS29.Sawetara interaksi lan kompleks protein-protein sing bisa dipercaya banget wis diidentifikasi, lan interaksi anyar wis diteliti luwih lanjut nggunakake co-immunoprecipitation lan owah-owahan konformasi kompleks nggunakake pemodelan dinamika molekul (MD) (Gambar 2) 30, 31.
Gambaran skematis metode CLMS.Sel Flo-1 diobati kanthi 10 ng/ml IFNα sajrone 24 jam banjur disambungake protein in situ kanthi nggunakake DSS diikuti lisis sel lan trypsinization.Sampel sing disambung silang dianalisis nggunakake spektrometer massa Orbitrap lan luwih sampel kanggo fragmentasi prekursor peptida sajrone LC-MS / MS.Rong peptida sing disambung diidentifikasi saka spektrum sing dipikolehi kanthi nggunakake program Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), lan kabeh senyawa digabung dadi jaringan kompleks nggunakake pipa komputasi.Nyaring interaksi kapercayan sing kurang adhedhasar skor tingkat positif palsu (FDR).Sawetara interaksi protein-protein dhuwur-kasetyan anyar luwih dikonfirmasi nggunakake co-immunoprecipitation, lan owah-owahan konformasi ing komplek diteliti nggunakake pemodelan dinamika molekul (MD).
Gunggunge ~ 30,500 lan ~ 28,500 peptida dideteksi nggunakake MaxQuant ing sampel IFNα sing ora dirangsang lan dirangsang (Tabel Tambahan S1, Gambar 3A).Distribusi dawa peptida ing loro kasus kasebut nuduhake proporsi peptida sing luwih gedhe, nuduhake anané peptida sing disambung silang (Gambar 3B,C).Kajaba iku, proporsi peptida sing luwih gedhe ana ing kisaran 40-55 ing sampel sing diobati IFNα (Gambar 3C).Pemetaan protein marang intensitas log2 nuduhake yen protein sing dirangsang interferon klasik paling akeh dibandhingake karo conto sing ora diobati, kalebu MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, lan HLA-F (Gambar 3D).Analisis jalur kanggo protèin luwih saka telung lipat sing diperkaya kanggo nanggepi perawatan IFNα nggunakake basis data jalur Reactome nuduhake yen presentasi lan pangolahan antigen sing dimediasi MHC-I minangka jalur sing paling dominan (Gambar 3E).Konsisten karo laporan sadurunge, respon antivirus sing dimediasi dening OAS lan ISG15 uga IFNα / β lan sinyal sitokin ana ing antarane jalur sing diaktifake.Kajaba iku, lysine- lan serine-spesifik protein cross-links diidentifikasi saka spektrum MS / MS asline nggunakake SIM-XL.Panaliten anyar nglaporake 104 ISG sing kalebu 20 virus saka 9 kelas virus kanthi meta-analisis studi overekspresi ISG individu ing 5 jinis sel9.Nanging, kanggo ngatasi watesan komputasi saka screening dataset gedhe, kita miwiti karo dataset cilik kanggo njelajah kemungkinan interaksi antarane dhaptar gen IRDS sing dilapurake dening Padaria et al., sing paling akeh yaiku ISG.
Identifikasi protein sing digandhengake kanthi beda kanggo nanggepi IFNα (data sing dipikolehi saka MaxQuant).(A) Diagram Venn sing makili jumlah peptida umum lan eksklusif sing diidentifikasi ing conto Flo-1 IFNα14 sing diobati lan ora diobati.Distribusi dawa peptida saka sampel silang sing ora diobati (B) lan IFNα sing diobati (C).(D) Peta panas sing nuduhake log2 (intensitas LFQ) antarane sel Flo-1 sing ora diobati lan IFNα14 sing diobati.Panel kiwa nuduhake protein sing paling aktif aktif ing ngarsane IFNα.(E) Histogram sing makili 20 jalur pengayaan utama sawise perawatan IFNα.Basis data jalur Reactome nganalisa luwih saka kaping papat owah-owahan ing protein responsif IFNα sing diatur.
Stimulasi ISG sing dimediasi interferon wis didokumentasikan kanthi apik, nanging ing tingkat molekuler kurang dimangerteni kepiye protèin kasebut dadi puncak ing macem-macem fungsi biologis.Kita nyelidiki interaksi protein kanthi tingkat kapercayan sing dhuwur ing antarane ISG sing dikenal.Apike, kita nemtokake jaringan kalebu protein MX1, USP18, ROBO1, OAS3, lan STAT1 sing mbentuk kompleks gedhe kanggo nanggepi perawatan IFNα (Gambar 4, Tabel S2) 32,33,34.Sing paling penting, interaksi kasebut ditemokake ing kabeh triplicates sing diobati karo IFNα lan ora ditemokake ing conto sing ora diobati, sing nuduhake yen padha dibentuk khusus kanggo nanggepi perawatan IFNα.Dikenal yen STAT1 kanthi transkripsi ngatur ekspresi ISG kasebut, nanging interaksi karo ISG ing tingkat protein durung diteliti.Struktur kristal STAT1 nuduhake yen domain heliks (CCD) ora melu interaksi karo DNA utawa protomer sajrone pambentukan dimer35.α-heliks iki mbentuk struktur heliks heliks sing nyedhiyakake area lumahing hidrofilik kanggo interaksi 35 .Ing data CLMS kita, kita diamati manawa akeh interaksi karo STAT1 dumadi ing domain SH2 sadurunge CCD, domain linker, utawa buntut C-terminal (residu 700-708) (Gambar 4A).Panaliten sadurunge nglapurake yen USP18 ngiket menyang domain CCD lan DNA-binding (DBD) saka STAT2 lan direkrut menyang subunit saka reseptor interferon tipe I IFNAR2 kanggo mediasi inhibisi sinyal interferon tipe I 24.Data kita uga nuduhake yen domain katalitik USP18 berinteraksi karo STAT1 DBD (Gambar 4A, D), nuduhake yen STAT1 lan STAT2 bisa uga nduweni peran kanggo narik USP18 menyang IFNAR2.
Jaringan ISG protein-protein sing diidentifikasi ing sel sing disambung silang sing diobati karo IFNα.(A) Plot interaksi 2D sing nuduhake interaksi protein-protein (digawe ing program SIM-XL), kanthi garis sing nuduhake interaksi antarmolekul (cutoff crosslink disetel dadi 3.5).Domain saka identitas sing beda-beda ditandhani kanthi werna32: domain MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), lan GED (569–660).Domain OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), lan OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) lan fn3 (777–864).Kolom STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), lan STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Penampil bunder saka protein sing digandhengake salib (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, lan STAT1) kanthi interaksi lan interaksi kanthi label biru lan abang.Ambang cross-link disetel ing 3.5.Plot titik nuduhake situs interaksi STAT1 karo MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), lan OAS3 (F), uga situs interaksi K utawa S antarane loro peptida.Ing gambar kasebut, ambang skor cross-link disetel dadi 3.0.(G) Various situs interaksi antarane STAT1 lan OAS3 DI domain superimposed ing struktur protein ing PyMol (PyMOL sistem grafis molekuler, versi 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) lan OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
Rong isoform saka USP18 wis diterangake ing manungsa, protein full-length sing utamané dumunung ing nukleus, lan isoform tanpa domain N-terminal, USP18-sf, kang disebarake merata ing sitoplasma lan nukleus 36.Kajaba iku, N-terminus diprediksi ora terstruktur lan ora mbutuhake aktivitas isopeptidase utawa ikatan ISG1537.Umume interaksi sing diidentifikasi ing panliten kita ana ing terminal N saka protein, nuduhake yen interaksi kasebut kalebu USP18 kanthi lengkap (Gambar 4A, D) lan bisa uga ana ing inti.Kajaba iku, data kita uga nuduhake yen N-terminus khusus kanggo interaksi protein-kanggo-protein.Situs naleni IFNAR2 dumunung ing antarane residu 312-368, lan utamane, ora ana protein ing kompleks sing ana ing wilayah iki (Gambar 4A) 37,38.Data kasebut bebarengan nuduhake yen domain pengikat IFNAR2 digunakake sacara eksklusif dening protein reseptor.Kajaba iku, mung OAS3 lan ROBO1 ditemokake sing ana hubungane karo domain hulu situs pengikat N-terminus lan IFNAR2 (Gambar 4A).
ROBO1 kalebu superfamili immunoglobulin (Ig) saka molekul sinyal transmembran lan kasusun saka limang domain Ig lan telung domain fibronektin (Fn) ing wilayah ekstraselular.Domain ekstraselular iki diterusake dening wilayah membran-proksimal lan heliks transmembran tunggal 39. Wilayah intraselular sing ora terstruktur dumunung ing terminal C lan ngemot motif urutan konservasi sing dadi mediasi ikatan protein efektor39.Wilayah sing dumadi saka asam amino ~ 1100 nganti 1600 biasane ora teratur.Kita nemokake yen MX1 sesambungan karo ROBO1 liwat Ig, Fn, lan domain intraselular, nalika paling interaksi karo STAT1 dumadi ing antarane CCD, domain linker, lan C-terminus ROBO1 (Fig. 4A, E).Ing sisih liya, interaksi karo wilayah linker DI, DIII, lan OAS3 disebarake ing protein ROBO1 (Fig. 4A).
Kulawarga protein oligoadenylate synthase (OAS) nampa lan ngiket RNA untai ganda intraselular (dsRNA), ngalami owah-owahan konformasi, lan nyintesis oligoadenylates 2′,5′-linked (2-5 As) 40.Ditemokake ing antarane telung OAS, OAS3 nuduhake afinitas paling dhuwur kanggo dsRNA lan nyintesis jumlah paling sethithik 2-5 As, sing bisa ngaktifake RNase L lan kanthi mangkono mbatesi replikasi virus 41.Kulawarga OAS kasusun saka domain transferase nukleotida kaya polimerase beta (pol-β).Panaliten sadurunge wis nuduhake yen aktivitas katalitik saka domain C-terminal (DIII) gumantung marang domain pengikat dsRNA (DI), sing dibutuhake kanggo aktivasi OAS342.Kita mirsani yen domain DI lan DII saka OAS3 berinteraksi karo CCD lan wilayah persimpangan cilik antarane SH2 lan STAT1 TAD (Gambar 4A, F).Overlaying situs crosslinking beda ing struktur protein dicethakaké interaksi antarane β-sheet lan DBD STAT1 daur ulang lan kanthong mbukak utawa growong kawangun dening residu 60-75 ing domain DI saka OAS3 (Fig. 4G).Orientasi protein ing kompleks kasebut uga nuduhake yen ora ana interaksi karo OAS3 sing ngganggu kemampuan ngiket DNA saka domain DI (Fig. S1A).Kajaba iku, domain N-terminal saka GTPase MX1 interaksi ekstensif karo domain DI lan DIII saka OAS3 (Fig. 4A).Kita uga mirsani interaksi antarane OAS1 lan MX1 ing kabeh telung ulangan sing diobati IFNα, ing ngendi siji domain OAS1 (uga aktif sacara katalitik) berinteraksi karo kabeh telung domain MX1 (Gambar S2A, B).
Protein MX minangka bagéan saka kulawarga gedhe GTPase kaya dynein sing ngemot domain GTPase N-terminal sing ngiket lan nghidrolisis GTP, domain penengah sing dadi mediasi self-assembly, lan zipper leucine terminal C sing tumindak minangka GTPase (LZ). ).domain efektor domain25,43.MX1 ngiket subunit polimerase virus kanggo ngalangi transkripsi gen virus43.Layar loro-hibrida ragi sing dilapurake sadurunge nuduhake yen MX1 sing digandhengake karo PIAS1 nyegah aktivasi gen sing dimediasi STAT1 kanthi ngalangi aktivitas pengikat DNA lan uga nduweni aktivitas ligase SUMO E344,45.Ing kene, kita nuduhake yen MX1 ngiket STAT1 (Gambar 4C, D), nanging kepiye interaksi iki mengaruhi aktivasi gen sing dimediasi STAT1 kanggo nanggepi IFNα mbutuhake sinau luwih lanjut.Kajaba iku, kita uga nemokake yen MX1 berinteraksi karo IFIT3 lan DDX60 ing kabeh telung ulangan sing diobati IFNα (Fig. S2C).
DDX60 minangka helikase sitoplasma sing diinduksi IFN sing sadurunge wis dilaporake duwe peran ing degradasi RNA46 virus sing ora gumantung saka RIG-I.Interaksi karo RIG-I lan ngaktifake sinyal kanthi cara spesifik ligan 46. DDX60 kasusun saka domain helikase DEXD / H-Box lan domain helikase terminal C sing ngiket RNA virus lan DNA47.Umume interaksi karo MX1 lan IFIT3 dumadi ing wilayah terminal N lan C sing dawa tanpa domain utawa motif kanonik (Gbr. S2E, F).Nanging, MX1 uga digandhengake karo domain helikase DEXD / H-Box (Fig. S2E).Protein saka kulawarga IFIT duwe salinan tandem saka motif helix-turn-helix khas sing diarani tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 ditemokake minangka modulator positif saka sinyal RIG-I lan dadi komponen kompleks MAVS.Digabungake, data kita nuduhake yen IFIT3 lan DDX60 berinteraksi utamane ing wilayah antarane TPR 3-6 saka IFIT3 lan bisa uga nduweni peran ing sinyal RIG-I / MAVS (Fig. S2F).
Amarga screening kabeh proteome iku intensif komputasi, kita banjur nyaring kabeh database UniProt manungsa kanggo anané salah siji saka baleni IFNα-dianggep.Ing replika iki, kita nemokake sawetara jaringan interaksi sing dipercaya banget kanggo HLA-A.Analisis jalur protein sing diidentifikasi dening spektrum MS / MS nuduhake yen pangolahan lan presentasi antigen adhedhasar MHC-I minangka jalur utama sing diakibatake dening interferon (Gambar 3D).Mula, kita fokus kanggo nyinaoni interaksi protein molekul MHC-I kanthi tingkat kapercayan sing dhuwur ing kabeh conto sing ana gandhengane.HLA kasusun saka domain α1, α2 lan α3 lan ranté cahya, lan microglobulin β2 (β2m) minangka protein chaperone konstan49.Sawise dirakit ing retikulum endoplasma, HLA ora stabil yen ora ana ligan peptida50.Alur pengikat peptida dibentuk dening domain α1 lan α2 sing polimorfik lan ora terstruktur kanthi bentuk non-peptida lan domain α351 sing relatif kurang polimorfik.Ing ngarsane IFNα, kita ndeteksi loro kompleks HLA-A: siji interaksi karo HMGA1 lan H2B (Gambar 5, Tabel S3) lan liyane interaksi karo MDN1, LRCH4 lan H2B (Gambar 6).
IFNα ngindhuksi jaringan interaksi HLA-A karo H2B (H2BFS) lan HMGA1.(A) plot 2D (digawe ing piranti lunak SIM-XL) sing nggambarake macem-macem jinis interaksi ing kompleks H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (biru), interlink (abang) lan link siji (ireng)..Domain saka identitas sing beda yaiku kode warna32: H2B (histone; 2–102) lan MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 lan MHC_I_C; 337–364).Ambang cross-link disetel ing 3.5.Plot titik nuduhake situs interaksi HLA-A karo H2B (B) lan HMGA1 (C), uga situs interaksi K utawa S antarane loro peptida.Ing gambar kasebut, ambang skor cross-link disetel dadi 3.0.(D) Hubungan antarane protein sing ditampilake ing struktur protein H2B, HLA-A, lan HMGA1 ing program PyMOL.Struktur kasebut dimodelake nggunakake server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) lan struktur template kanggo protein H2B, HLA-A lan HMGA1 yaiku 1kx552, 1kj349 lan 2eze55.
IFNα ngindhuksi jaringan interaksi HLA-A karo H2B (H2BFS), MDN1 lan LRCH4.(A) Crosslinks Intramolecular (abang) lan intermolecular (biru) ditampilake ing peta interaktif 2D (digawe ing piranti lunak SIM-XL) karo MDN1 dituduhake minangka bunder.Ambang cross-link disetel ing 3.5.Domain saka identitas sing beda yaiku kode warna32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 lan MHC_I_C; 337–364) lan LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) lan CH (535–641)).(B) Hubungan antarane protein sing ditampilake ing struktur protein H2B, HLA-A, LRCH4, lan MDN1 ing program PyMOL.Struktur kasebut dimodelake nggunakake server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) kanthi struktur template 1kx552, 1kj349, 6hlu62 lan 6i2665 kanggo protein H2B, HLA-A, LRCH4 lan MDN1, mungguh.Plot titik nuduhake situs interaksi K utawa S kanggo HLA-A karo H2B (C), LRCH4 (D), lan MDN1 (E).Kanggo plot, ambang skor cross-link disetel dadi 3.0.
Saliyane njaga integritas genom, histon H2B uga melu regulasi transkripsi.Protein H2B kasusun saka domain histon pusat (HFD) sing dibentuk dening telung heliks α sing dipisahake dening loop lan buntut terminal C 41,52.Umume interaksi karo H2B dumadi ing heliks α1, sing nyedhiyakake trimerisasi karo heterodimer HFD (Gambar 5A, B).Sanajan lisin melu ikatan DNA, sawetara lisin uga minangka situs asetilasi utawa metilasi alternatif.Contone, residu K43, K46, lan K57 saka H2B ora melu ikatan DNA langsung, nanging minangka target saka macem-macem modifikasi pasca-transkripsi53.Kajaba iku, residu K44, K47, lan K57 ing H2B bisa dadi peran alternatif ing ngarsane IFNα, kalebu interaksi karo protein liyane (Gambar 5A, B).Kajaba iku, histon extrachromosomal H2B ngaktifake respon imun ing macem-macem jinis sel, tumindak minangka sensor cytosolic kanggo ndeteksi fragmen DNA untai ganda (dsDNA) sing asalé saka agen infèksius utawa sel sing rusak54.Ing ngarsane virus DNA, deplesi H2B nyandhet produksi IFN-β lan fosforilasi STAT154.H2B uga dikenal kanggo pindhah lan metu saka inti luwih cepet saka histones inti liyane54.Interaksi H2B karo MDN1 lan LRCH4 uga diamati ing sampel sing ora diobati.Kita nemokake manawa HLA-A berinteraksi karo H2B ing kabeh telung conto sing diobati IFNα lan ing siji sampel ulang sing ora diobati.Data kasebut nggambarake peran H2B ing fungsi fisiologis alternatif bebas saka regulasi transkripsi.
HMGA1 (grup mobilitas dhuwur AT-Hook 1), nukleoprotein cilik sing sugih ing asam amino sing nyebabake penyakit, wis diidentifikasi kanthi asosiasi karo HLA-A.Nduweni buntut C-terminal asam lan telung DBDs béda disebut AT pancingan amarga padha ikatan menyang alur suntingan saka wilayah sugih AT ing dsDNA55,56.Ikatan iki nyebabake DNA mlengkung utawa lurus, ngidini faktor transkripsi kanonik ngakses urutan konsensus.Buntut C-terminal diyakini melu interaksi protein-protein lan rekrutmen faktor transkripsi, amarga mutan penghapusan terminal C ora bisa miwiti transkripsi57.Kajaba iku, domain iki ngemot sawetara situs fosforilasi sing dikonservasi sing dikenal minangka substrat kinase 58.Kita diamati interaksi HLA-A lan H2B karo HMGA1 njaba domain C-terminal, nuduhake yen domain C-terminal utamané digunakake kanggo transkripsi faktor naleni (Fig. 5A, C).Protein HMGA saingan karo histone H1 kanggo ngiket DNA adaptor, saéngga nambah aksesibilitas57.Kajaba iku, misale jek HMGA sesambungan karo histone H2B bebarengan DNA linker ing kompetisi karo histone H1.HMGB1 nyebabake ekspresi HLA-A, -B, lan -C ing sel dendritik, sing nyebabake aktivasi59, nanging interaksi antara HMG lan HLA durung dilaporake sadurunge.Kita nemokake yen HMGA1 sesambungan karo domain α1 lan α3 saka HLA-A, kanthi akeh interaksi ing njaba 3 DBD (Gambar 5A, C).Ing tangan kita, HLA-A ditemokake dilokalisasi ing inti (data ora ditampilake), lan amarga H2B lan HMGA1 uga ana ing inti, interaksi iki bisa uga ana ing inti.Tambahan spesifik sing diukur antarane H2B, HLA-A, lan HMGA1 ditampilake ing Gambar 5D.
Umume interaksi HLA-A karo protein liyane dumadi ing domain α1 lan α2 lan domain terminal C sing ora teratur (Gambar 6).Ing salah sawijining conto kasebut, kita nemokake manawa HLA-A berinteraksi karo buntut N-terminal LRCH4 (Gambar 6A, D).LRCH4 ngatur aktivasi TLR4 lan induksi sitokin LPS, saéngga modulasi respon imun bawaan60,61.Iki minangka protein membran kanthi sembilan ulangan kaya leucine (LRRs) lan motif homologi calmodulin (CH) ing ectodomain, diikuti karo domain transmembrane (TMD) 60, 62.Domain CH wis dilapurake kanggo mediasi interaksi protein-protein 60.Babagan udakara 300 asam amino ing antarane domain LRR lan CH relatif bisa diakses nanging ora teratur.Adhedhasar fungsi wilayah sing ora teratur minangka mediator jaringan protein-protein lan transportasi vesikular 63, kita nemokake manawa interaksi protein paling akeh dumadi ing wilayah sing ora teratur.Interaksi karo MDN1 disebarake ing saindhenging dawa protein, kalebu domain LRR1, LRR6, CH, lan wilayah acak, dene H2B utamane terikat karo domain CH (Gambar 6A, B).Utamane, ora ana interaksi sing kalebu TMJ, sing nuduhake kekhususan pendekatan CLMS (Gambar 6A, B).
MDN1 uga wis diidentifikasi minangka bagéan saka jaringan protein HLA-A (Gambar 6A).Iki kalebu kulawarga protein AAA (ATPase sing ana gandhengane karo macem-macem kegiatan).Iki minangka domain AAA N-terminal sing padha sing diatur dadi cincin heksamerik lan mbusak faktor perakitan saka subunit ribosom 60S 64.katon padha karo dynein64,65,66.Kajaba iku, wilayah sugih Asp / Glu diterusake karo domain MIDAS (situs gumantung ion logam).Amarga ukuran gedhe saka MDN1 (kira-kira 5600 asam amino) lan homologi winates karo protèin sing diteliti kanthi apik, ora ana sing ngerti babagan struktur lan fungsine ing manungsa.Kita nemtokake HLA-A, H2B, lan LRCH4 minangka mitra pengikat MDN1 lan nuduhake orientasi minangka kompleks protein ing PyMol (Gambar 6A, B).Telung protein iki sesambungan karo domain AAA, domain linker kaya dynein, lan bisa uga domain MIDAS MDN1.Ing laporan sadurunge, pemurnian afinitas protein umpan ngenali MDN1 minangka protein sing ana gandhengane karo histone H2B67.Kajaba iku, panaliten anyar uga nglaporake interaksi antara MDN lan HLA-B ing sel HCT116 nggunakake spektrometri massa sing dimurnikake afinitas, ndhukung temuan68.Identifikasi kompleks iki ing conto sing diobati IFNα nuduhake peran MDN1 ing sinyal interferon.
Amarga gen HLA polimorfik banget, kita ngekstrak urutan maca pemetaan HLA-A, -B, lan -C saka data urutan RNA sel Flo-1 (data ora ditampilake).Urutan peptida sing konsisten karo maca urutan nuduhake beda sing signifikan antarane HLA-A, -B, lan -C ing wilayah ing ngendi peptida sing disambung silang ana ing HLA-A (Gambar S3).Kajaba iku, kita ora mirsani protein-kanggo-protein cross-linking molekul HLA-B / C karo protein H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4.Iki nuduhake yen interaksi protein sing ditemokake ing antarane HLA-A, MDN1, LRCH1 lan HMGA1 spesifik HLA-A.Kajaba iku, analisis proteomik saka sampel non-crosslinked (Tabel S4) nuduhake yen HLA-A nduweni jangkoan urutan sing luwih dhuwur tinimbang HLA-B utawa HLA-C.Peptida sing diidentifikasi kanggo HLA-A nduweni intensitas dhuwur ing conto sing diobati IFNα lan sing ora diobati.
Kanggo mesthekake yen interaksi sing diidentifikasi ing kene ora amarga hubungan silang non-spesifik saka rong protein ing jarak spasial sing cedhak, kita luwih ngonfirmasi loro faktor interaksi HLA-A anyar kanthi nindakake tes co-immunoprecipitation.Interaksi HLA-A karo MDN1 lan H2B endogen dideteksi ing sel Flo-1 sing diobati IFNα lan ora diobati (Gambar 7, Gambar S4).Kita dikonfirmasi manawa HLA-A dijupuk dening H2B ing immunoprecipitates lan asosiasi iki amarga perawatan IFNα amarga HLA-A ora ana ing conto immunoprecipitate saka sel sing ora diobati (Gambar 7A).Nanging, data kita nuduhake yen IFNα beda-beda ngatur ikatan HLA-A menyang H2B lan MDN1.IFNα nyebabake asosiasi antara H2B lan HLA-A, nanging nyuda asosiasi karo MDN1.Kita nemokake yen MDN1 digandhengake karo HLA-A ing kontrol, lan tambahan IFNα nyuda interaksi iki kanthi bebas saka induksi MDN1 dening IFNα (Gambar 7B, C).Kajaba iku, immunoprecipitation HLA-A nangkep H2B ing sel A549 (Gambar S4), nuduhake yen interaksi iki ora gumantung saka jinis sel.Digabungake, asil kasebut ndhukung interaksi interferon-mediated HLA-A karo H2B lan MDN1.
HLA-A co-purify H2B lan MDN1.Imunoblots H2B endogen (A) lan MDN1 (B) sing perwakilan diimunoprecipitated saka sel Flo-1 sing diobati IFNα lan diuji kanggo antibodi sing dituduhake.IgG tikus lan terwelu digunakake minangka kontrol negatif.(C) Jumlah relatif (input) antigen sing beda-beda digambarake dening immunoblots sing diteliti marang antibodi sing dituduhake, β-aktin digunakake minangka kontrol loading.
Sifat-sifat struktural saka salah sawijining jaringan interferon sing bisa dipercaya banget, H2B-HLA-A-HMGA1, diselidiki.Kita nggunakake pemodelan dinamika molekul minangka pendekatan alternatif kanggo mangerteni dinamika konformasi protein sing ana ing kompleks iki (Gambar 8).Inferensi saka data CLMS nuduhake kemungkinan konformasi sing beda saka protein H2B, HLA-A, lan HMGA1.Mulane, kompleks potensial ing ngisor iki dimodelake ing medium pelarut: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, lan H2B-HLA-A-HMGA1.Layar docking protein-protein awal nggunakake paket MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) nyaranake konformasi sing bisa beda-beda ing antarane protein kasebut (Gambar 8A).Visualisasi kompleks protein docking nuduhake sawetara interaksi lan kemungkinan konformasi (Gambar 5A, 8).Mangkono, siji konformasi bisa ditampilake ing Figure 8A (kanthi pranala salib label) lan luwih dievaluasi nggunakake pipa modeling MD.Kajaba iku, ikatan H2B utawa HMGA1 menyang HLA-A nyoroti afinitas sing luwih dhuwur saka H2B kanggo HLA-A (Gambar 8A).
Dinamika konformasi jaringan sing bisa ditindakake ing antarane kompleks H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, lan H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Panel kiwa minangka peta 2D (digawe ing piranti lunak SIM-XL) saka intermolecular (abang) lan intermolecular (biru) crosslinks (crosslink cutoff disetel kanggo 3,5).Kajaba iku, residu ikatan silang sing diidentifikasi diwenehi label ing struktur protein H2B, HLA-A, lan HMGA1.Konformasi sing gegandhengan karo protein kasebut diekstrak nggunakake pipa docking sing diimplementasikake ing paket MOE.Panel kiwa ngisor nuduhake macem-macem kemungkinan konformasi kompleks H2B-HLA-A lan HMGA1-HLA-A kanthi afinitas ikatan protein-protein sing beda (GBVI / WSA dG; kcal / mol).(B) Standar deviasi (RMSD) posisi atom (ora kalebu atom hidrogen) kanggo saben struktur protein.(C) Intermolecular protein-protein ikatan hidrogen interaksi saka macem-macem simulasi Komplek considering interaksi tartamtu saka durasi ≥ 10 ns.Jarak cutoff donor-acceptor ikatan h disetel dadi 3.5 Å, lan sudut potong donor-H-acceptor disetel dadi ≥ 160°–180°.(D) Residu label sing mbentuk interaksi protein-protein HLA-A karo mitra masing-masing, ≥ 20 ns, diekstrak saka kompleks HLA-A-H2B lan HLA-A-HMGA1.Struktur protein makili struktur rata-rata 100 ns MDS.(E) Interaksi antarane HLA-A-H2B lan HLA-A-HMGA1 komplek dibandhingake interaksi dilacak dening simulasi H2B-HLA liwat 100 ns adhedhasar situs interaksi K utawa S antarane loro peptida.Kompleks /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Nilai ambang kanggo evaluasi cross-links disetel kanggo 3.0, lan interaksi spesifik saka MDS njupuk ≥ 10 ns dijupuk menyang akun.Struktur protein digambarake nggunakake BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) lan paket Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilitas molekul HLA-A liwat wektu (standar deviasi; RMSD utawa standar deviasi; RMSF) nuduhake yen anané H2B utawa HMGA1 protein ing kompleks stabil HLA-A (Gambar 8B, Gambar S5).Protein HMGA1 ngiket banget menyang situs B2M HLA-A, nyebabake stabilitas asam amino HLA-A ing kompleks HLA-A-HMGA1 utawa H2B-HLA-A-HMGA1 (Gambar 8B, Gambar S5).utamané, residu HLA ~ 60-90 lan ~ 180-210 ditemokake kurang fleksibel ing ngarsane H2B (FIG. 8B).H2B lan HMGA1 nuduhake luwih naleni kanggo HLA-A ing Komplek H2B-HLA-A-HMGA1 dibandhingake HLA-A naleni kanggo H2B utawa HMGA1 piyambak (Figure 8C, D; Tabel S5).Residu sing melu ikatan hidrogen (MD modeled high occupancy ≥ 10 ns) bertepatan karo situs interaksi CLMS (residu K utawa S) ing kompleks kasebut, nuduhake yen interaksi sing diidentifikasi dening CLMS bisa dipercaya banget.Reliabilitas (Gambar 8E).Ing modeling CLMS lan MD, residu HLA-A antarane udakara 190-210 lan udakara 200-220 asam amino ditemokake kanggo ngiket H2B lan HMGA1 (Gambar 8E).
Interaksi protein-protein mbentuk jaringan struktur dinamis sing mediasi komunikasi intraselular kanggo nanggepi rangsangan tartamtu.Amarga akeh pendekatan proteomik ndeteksi owah-owahan ing tingkat stabil sakabèhé saka protein, dinamika interaksi protein-protein mbutuhake alat tambahan kanggo nangkep antarmuka naleni, lan CLMS minangka salah sawijining alat kasebut.Sistem sinyal interferon minangka jaringan sitokin sing ngidini sel nanggapi macem-macem sinyal patologis patogenik lan intrinsik lingkungan, sing puncake ing induksi subset saka protein interferon-inducible.Kita ngetrapake CLMS kanggo nemtokake manawa interaksi protein-protein novel bisa diidentifikasi ing antarane panel protein sing diakibatake interferon.Analisis cross-linking protein global ing model sel Flo-1 sing responsif interferon digunakake kanggo nangkep kompleks protein.Ekstraksi peptida tryptic saka sel non-link lan cross-linked ngidini kanggo ngitung peptida, pengayaan jalur, lan distribusi dawa peptida kanthi intensitas LFQ sing ditemtokake.Protein interferon-inducible kanonik diidentifikasi minangka kontrol internal sing positif, dene tambahan intermolekul lan intramolekul anyar saka interferon-inducible protein kanonik kayata MX1, UP18, OAS3 lan STAT1 diamati.Macem-macem fitur struktural lan interaksi ing wilayah fungsional wis diselidiki.
Interaksi antarane HLA-A, MDN1 lan H2B dideteksi kanthi immunoblotting ing sel Flo-1 lan A549 sing diobati lan ora diobati karo IFNα.Asil kita nyorot manawa kompleks HLA-A karo H2B kanthi cara gumantung IFNα.Pakaryan kita nggambarake dalan sing menarik kanggo eksplorasi luwih lanjut babagan lokalisasi loro kompleks kasebut.Iku uga menarik kanggo nggedhekake pendekatan CLMS menyang panel garis sel kanggo ngenali interaksi protein interferon-mediated sel-jinis bebas.Pungkasan, kita nggunakake modeling MD minangka pendekatan alternatif kanggo mangerteni dinamika konformasi protein sing ana ing kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, sing nglacak obrolan silang intramolekul lan intermolekul.Inferensi saka data CLMS nuduhake kemungkinan konformasi sing beda saka protein H2BFS, HLA-A, lan HMGA1.Konformasi sing beda-beda ing antarane kompleks protein docking iki nuduhake sawetara interaksi sing padha karo sing diamati ing dataset CLMS.Salah sawijining kekuwatan utama metode kita yaiku ngidini gampang identifikasi interaksi gen polimorfik kayata HLA, mula bakal menarik kanggo sinau interaksi protein khusus haplotype HLA sing angel ditliti.Digabungake, data kita nuduhake manawa CLMS bisa digunakake kanggo nggedhekake pangerten babagan jaringan sinyal sing diakibatake interferon lan menehi dhasar kanggo nyinaoni sistem interselular sing luwih kompleks ing lingkungan mikro tumor.
Sel Flo-1 dijupuk saka ATCC lan dikelola ing DMEM (Gibco) ditambah karo 1% penisilin / streptomycin (Invitrogen), 10% serum sapi janin (Gibco) lan disimpen ing 37 ° C lan 5% CO2.Inkubasi.Sel ditanam nganti 70-80% pertemuan sadurunge diobati karo IFNα14 (diprodhuksi dening Fasilitas Produksi Protein Edinburgh).Kabeh bahan kimia lan reagen liyane dituku saka Sigma Aldrich kajaba dicathet.
Sel Flo-1 dikultur ing piring 6 sumur lan dina sabanjure sel kasebut diobati kanthi 10 ng / ml IFNα14 suwene 24 jam nganti kira-kira 80% pertemuan.Sel wis dikumbah kaping telu nganggo PBS lan diikat nganggo DSS (Thermo Fisher Scientific) sing anyar (dilarutake ing DMSO) ing PBS sajrone 5 menit ing 37 ° C nganti konsentrasi pungkasan 0,5 mM.Reaksi crosslinking DSS diganti karo PBS lan sisa DSS dipateni kanthi nambahake 20 mM Tris (pH 8.0) ing PBS suwene 15 menit ing 37 ° C.Sèl diklumpukake kanthi scraping lan diklumpukake ing tabung pengikat sing kurang (Aksigen).
Pelet sel kasebut dilisis karo 300 µl buffer lisis urea (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) suwene 30 menit ing suhu kamar kanthi goyang-goyang.Kabeh langkah sentrifugasi ditindakake ing 14.000 xg ing 8 ° C.Centrifuge lysate kanggo 10 menit lan transfer supernatant menyang tabung anyar.Partikel bening sing isih ana dibubarake ing 150 μl buffer lisis kapindho (2 M urea, 2% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) suwene 30 menit utawa luwih nganti larutan banyu homogen dipikolehi.Lysate disentrifugasi nganti 20 menit lan supernatan dicampur karo lysate sing dipikolehi ing langkah sadurunge.Konsentrasi protein ditaksir nggunakake tes Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) miturut pandhuan pabrikan kanggo prosedur microplate.Sampel kasebut cepet beku ing nitrogen cair lan disimpen ing -80 ° C.
Kira-kira 100 μg protein cross-linked larut diproses nggunakake protokol persiapan sampel filtrasi sing dimodifikasi (FASP) kaya sing diterangake dening Wisniewski et al.69 Sedhela, protein disambung silang karo 200 µl buffer urea (8 M urea ing 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexed lan setengah.Kabeh langkah sentrifugasi ditindakake ing 14.000 xg ing 25 ° C.Setengah pisanan saka lysate protein salib-link ditransfer menyang 10 kDa Microcon piranti Filter centrifugal dilengkapi membran Ultracel-10 (Merck), ngiring dening centrifugation ing Filter kanggo 25 menit.Banjur tambahake setengah saka protein menyang saringan lan baleni langkah sing padha.Pemulihan protein ditindakake kanthi nambahake 100 μl saka 17 mM tris (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) ing buffer urea.Recovery diaduk ing thermomixer ing 600 rpm kanggo 30 menit ing 37 ° C.Kajaba iku, kolom disentrifugasi lan protein salib sing dikurangi dialkilasi nggunakake 100 μl iodoacetamide 50 mM ing buffer urea.Reaksi alkilasi ditindakake ing suhu kamar suwene 20 menit ing peteng.Puter kolom, cuci tembok kolom kaping telu nganggo buffer urea 100 µl, banjur centrifuge.Operasi sing padha ditindakake kaping 3 kanthi nggunakake 100 μl 100 mM amonium bikarbonat.Sadurunge trypsinization, ganti tabung koleksi karo sing anyar.Tambah buffer pencernaan sing ngemot 50 mM amonium bikarbonat lan 1 µl tripsin sing diencerake ing buffer tripsin (Promega).Rasio trypsin kanggo protein dijaga kira-kira 1:33, lan reaksi pencernaan diinkubasi sewengi ing suhu 37 ° C ing kamar sing lembab.Peptida sing disambung silang dielusi saka saringan kanthi sentrifugasi suwene 25 menit.Pemulihan peptida ditingkatake kanthi nambahake 50 μl NaCl 0,5 M menyang saringan, banjur disentrifugasi suwene 25 menit.
C18 Micro Spin kolom (Harvard Apparatus) digunakake kanggo desalt salib-linked peptida tryptic ngisor protokol diterangake dening Bouchal et al.70 karo modifikasi suntingan.Sedhela, kolom spin C18 diaktifake kanthi telung cuci asam format (FA) 0,1% ing asetonitril (AcN) (Merck) lan rong cucian 0,1% FA.Kolom kasebut dihidrasi kanthi FA 0,1% suwene 15 menit.Muat conto menyang kolom muter lan wisuh 3 kaping karo 0,1% FA.Peptida desalted diencerake kanthi urutan kanthi gradien kanthi bertahap nggunakake 50%, 80% lan 100% AcN ing 0.1% FA.Sampel dikeringake ing konsentrator SpeedVac Plus (Eppendorf) nganti sisa cairan ilang.Peptida eluted dibubarake ing 100 μl asam trifluoroacetic 0,08% ing 2,5% AcN lan konsentrasi diukur ing NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Kira-kira 1 μg peptida crosslinked saben sampel disuntikake menyang sistem LC-MS / MS.
Peptida sing disambung silang dipisahake ing sistem UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) sing disambungake menyang spektrometer massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptida cross-linked diklumpukake ing ID 300 µm, kolom tangkapan C18 µ-pre-column dawa 5 mm sing dikemas karo sorben C18 PepMap100 lan sorben PepMap 5 µm (Thermo Scientific).Muat set aliran pompa ing 5 µl / min 0,08% asam trifluoroacetic larut ing 2,5% AcN.Peptida sing disambung silang dipisahake ing kolom silika sing digabung analitik kanthi diameter batin 75 μm lan dawane 150 mm, diisi karo sorben PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Fase seluler A lan B dumadi saka 0,1% FA ing banyu lan 0,1% FA ing asetonitril.Gradien diwiwiti kanthi 2,5% B lan mundhak linear dadi 40% B sajrone 90 menit, banjur dadi 90% B sajrone 2 menit sabanjure.Komposisi fase seluler dipertahanake ing 90% B sajrone 10 menit lan banjur mudhun kanthi linear dadi 2,5% B sajrone 2 menit.Kolom kasebut diimbangi kanthi 2,5% B suwene 8 menit sadurunge siklus sabanjure.Peptida salib sing disambungake saka kolom analitik diionisasi ing sumber ionisasi nanoelectrospray (NSI) lan disuntikake menyang spektrometer massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spektrometer massa Orbitrap Exploris 480 dioperasikake ing mode korélasi data positif.Pindai lengkap ditindakake ing mode bagean kanthi resolusi 120.000 kanthi setelan kisaran saka m/z 350 Th nganti m/z 2000 Th.Target AGC sing dinormalisasi disetel ing 300% kanthi wektu input maksimal 50ms.Deteksi puncak monoisotopik wis ditetepake kanggo peptida.Parameter relaksasi kendala disetel dadi bener yen prekursor sithik banget ditemokake.Kekuwatan ion minimal saka prekursor disetel dadi 5.0e3 lan muatan prekursor nganti +8 kalebu ing eksperimen.
Wektu siklus antarane pindai utama ing mode korélasi data disetel dadi 2,5 detik.Pengecualian massa dinamis disetel dadi 20 detik sawise fragmentasi pisanan ion prekursor.Jendhela isolasi prekursor disetel dadi 2 Th.Jinis energi tabrakan sing dinormalisasi kanthi mode energi tabrakan tetep dipilih ing pindai MS / MS sing gumantung data.Energi tabrakan disetel dadi 30%.Resolusi Orbitrap disetel dadi 15.000 lan target AGC dadi 100%.Wektu injeksi maksimum khusus disetel dadi 60 milidetik.
Sadurunge nelusuri jaringan protein-protein ing conto sing disambung silang, kita ngolah file mentah nggunakake paket MaxQuant (versi 1.6.12.0)26,27 kanggo ngenali peptida / protein sing bisa dilacak ing conto kasebut.Kajaba iku, analisis proteomik sing padha ditindakake ing conto Flo-1 sing ora disambungake lan ora diobati karo IFNα.Data MS/MS digoleki ing database manungsa UniProt (www.uniprot.org) (diunggah tanggal 12 Agustus 2020, ngemot 75,093 entri) nggunakake mesin telusur sing dibangun ing Andromeda27.Panelusuran ditindakake tanpa nuduhake kekhususan enzim lan macem-macem modifikasi deamidasi (N, Q) lan oksidasi (M).Toleransi massa prekursor disetel ing 20 ppm lan ion produk ing 0,02 Da.Penyimpangan massa awal lan maksimum disetel dadi 10 ppm.Massa maksimum peptida disetel ing 4600 Da lan persamaan urutan disetel antarane 7 lan 25 asam amino (aa).Analisis statistik luwih ditindakake nggunakake program Perseus (versi 1.6.10.45).Isi protein diitung kanthi normalake intensitas spektral protein (intensitas LFQ; kuantitas tanpa label)27 lan nilai intensitas diowahi dadi Log2.Klaster hirarkis protein sing diidentifikasi kanthi intensitas peptida dibangun nggunakake paket pheatmap (v1.0.12) ing R (v 4.1.2).Analisis pengayaan jalur ditindakake nggunakake basis data jalur Reactome kanggo protein sing diobati IFNα sing luwih saka kaping papat diaktifake dibandhingake karo sampel sing ora diobati.
Identifikasi lysine (K) utawa serine (S) crosslinks kimia spesifik kompleks protein sing dipantau dening LC-MS / MS ditindakake kanthi nggunakake mesin identifikasi spektroskopi (SIM-XL) kanggo peptida sing disambung silang (SIM-XL)29.Kaping pisanan, kemungkinan interaksi antarane gen DNA damage resistance signature (IRDS) sing gegandhengan karo interferon (IFN) diselidiki nggunakake dataset protein IRDS sing diterangake ing Padariya et al.28.Saringan kabeh kahanan lan mbaleni kabeh UniProt manungsa kanthi komputasi intensif, mula kabeh database UniProt manungsa (www.uniprot.org) (diundhuh 12 Agustus 2020, ngemot 75,093 entri) nglawan pengulangan sing diobati IFNα.Salah sawijining saringan kanggo interaksi kepercayaan sing dhuwur.Interaksi penting sing dipikolehi iki ditambahi lan diuji ing kabeh pengulangan lan kahanan.
Ing SIM-XL, DSS digunakake kanggo crosslinker (XL) lan shift bobot XL lan shift bobot modifikasi disetel kanggo 138,06 lan 156,07, mungguh.Situs reaksi crosslinking ing ngisor iki dianggep: KK, KS lan KN-TERM, tanpa ion reporter.Ppm prekursor lan fragmen disetel dadi 20 lan ambang Xrea disetel dadi 0.15.Trypsin dianggep pancen spesifik, lan metode fragmentasi C-trap (HCD) energi dhuwur ditindakake.Ambang pengurangan DB dinamis XCorr lan jumlah minimal peptida kanggo pengurangan DB dinamis disetel dadi 2.5 lan 2.Paramèter liyane yaiku: probabilitas monoisotop lan puncak ketepakan cutoff, minimal 4 residu AA saben untaian lan daya untai maksimum, lan 3 maksimum pamisah ora kejawab.Peta 2D sing diasilake dianalisis ing (SIM-XL) lan representasi grafis xQuest28 digunakake kanggo mbangun peta 2D.Crosslinks protein ing struktur protein kasedhiya ing PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versi 2.0 Schrödinger, LLC).
Struktur model protein digawe nggunakake server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 nggunakake prinsip modeling homologi lan implementasine "Metode Markov Tersembunyi".Phyre2 ngasilake struktur model adhedhasar keselarasan urutan karo struktur protein sing dikenal.Kanggo protein H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, lan MDN1, struktur template 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, lan 6i2665 digunakake.Kajaba iku, struktur AlphaFold71 MX1, UBP18 lan ROBO1 uga dianggep.Struktur protein digambarake nggunakake paket Visualizer Studio Discovery BIOVIA (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) lan paket Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).