ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Kanggo Komponen kimia Industri Kimia, Kekurangan SPECC1L nyebabake stabilitas sendi sing disambung lan nyuda sel crest saraf kranial.

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Sampeyan nggunakake versi browser kanthi dhukungan CSS winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nuduhake situs kasebut tanpa gaya lan JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Kanggo Industri Kimia

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.punika Produsèn anjog sing specialized ing pipe rapi stainless steel, tabung annealed padhang, seamless coiled tubing etc.Kanggo nggampangake pelanggan, kita uga duwe pipa lan tabung sing dilas.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.nduweni peralatan produksi lan uji coba sing paling maju.Kita bisa nyukupi kabutuhan sampeyan.Miturut standar sing ketat banget, tabung sing diprodhuksi dening kita mesthi duwe toleransi OD lan WT sing bener.Kontrol toleransi kanthi ketat kanggo ngasilake standar.Produk kita tansah wareg karo pelanggan.Pelanggan sing tuku produk kita nggawe bathi luwih akeh.
a) OD (Diameter njaba): 3.18mm nganti 101.6mm
b) WT (Ketebalan Tembok): 0.5mm nganti 20mm
c) Length: Miturut syarat customer
d) Standar: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) Cara Proses : ERW, EFW lsp

Slider nuduhake telung artikel saben slide.Gunakake tombol mburi lan sabanjuré kanggo mindhah liwat minger, utawa tombol controller geser ing mburi kanggo mindhah liwat saben geser.
Sel crest neural cranial (CNCC) ngeculake lipatan saraf embrio lan migrasi menyang lengkungan pharyngeal, sing mbentuk sebagian besar struktur midface.Disfungsi CNCC nduweni peran penting ing etiologi celah orofacial, malformasi kongenital sing umum.Mutasi SPECC1L heterozigot wis ditemokake ing pasien kanthi cleft atipikal lan sindrom.Ing kene, kita nglaporake pewarnaan komponen canonical adhesive junction (AJ), β-catenin lan E-cadherin ing sel knockdown SPECC1L sing dikultur, lan mikrograf elektron nuduhake difusi apikal-basal AJ.Kanggo mangerteni peran SPECC1L ing morfogenesis craniofacial, kita nggawe model mouse sing kurang Specc1l.Mutan homozigot yaiku embrio sing bisa nyebabake mati lan nuduhake cacat penutupan tabung saraf lan laminasi CNCC.Pewarnaan protein AJ tambah ing lipatan saraf mutan.Cacat AJ iki konsisten karo cacat ing delaminasi CNCC, mbutuhake pembubaran AJ.Kajaba iku, mutan Specc11 wis nyuda sinyal PI3K-AKT lan nambah apoptosis.In vitro, inhibisi entheng sinyal PI3K-AKT ing sel jinis liar cukup kanggo ngindhuksi owah-owahan AJ.Sing penting, owah-owahan AJ sing disebabake dening knockdown SPECC1L bisa dibalik kanthi aktivasi jalur PI3K-AKT.Digabungake, data kasebut nuduhake yen SPECC1L, minangka regulator novel sinyal PI3K-AKT lan biologi AJ, dibutuhake kanggo penutupan tabung saraf lan stratifikasi CNCC.
Sel crest neural cranial (CNCCs) localize menyang neuroectoderm dorsal lan ngeculake saka neuroepithelium saka lipatan saraf sing berkembang liwat proses sing nglibatake transisi epithelial-mesenchymal (EMT)1,2,3.CNCC epitel premigrasi ngganggu persimpangan intercellular lan dadi CNCC mesenchymal migrasi sing ngisi lengkungan pharyngeal pisanan lan kaloro lan mbentuk sebagian besar rawan craniofacial.Mangkono, gen sing ngatur fungsi CNCC asring diganggu ing etiologi anomali kongenital craniofacial kayata clefts orofacial, sing paling umum mengaruhi 1/800 lair ing AS piyambak.Salah sawijining cacat bawaan8.
Delaminasi CNCC bertepatan karo penutupan tabung saraf anterior antarane 8.5 lan 9.5 dina perkembangan embrio ing tikus.Mutan saka sawetara gen tikus orofacial cleft-related uga nuduhake sawetara wangun cacat tabung saraf, kalebu Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, lan Pdgfrα12.Nanging, proses penutupan tabung saraf lan stratifikasi CNCC bisa dianggep independen, amarga mouse mutan Splotch (Pax3) nuduhake cacat ing penutupan tabung saraf tanpa efek ing stratifikasi utawa migrasi CNCC 13,14.Model mouse tambahan kanthi cacat ing dissection CNCC lan penutupan tabung saraf bakal mbantu nggambarake basis molekul umum saka rong proses kasebut.
Isolasi CNCC saka sel neuroepithelial mbutuhake pembubaran sambungan adesif (AJs), sing kasusun saka kompleks protein sing ngemot, antara liya, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, lan α-aktinin sing ana gandhengane karo filamen aktin 2 Studi overexpression E-cadherin ing lipatan saraf nuduhake pengurangan utawa wektu tundha ing delaminasi CNCC.Kosok baline, supresi E-cadherin nyebabake stratifikasi awal15,16.Akeh faktor sing mediasi EMT sajrone stratifikasi CNCC yaiku faktor transkripsi (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) lan protein remodeling matriks ekstraseluler (ECM) kayata matrix metalloproteinase (MMPs), nanging CNCC minangka regulator AJ sitoskeletal langsung. durung dingerteni.Jalur PI3K-AKT dikenal minangka antagonis tingkat E-cadherin, utamane saka riset kanker17.Panaliten anyar nuduhake yen ilang sinyal PI3K-AKT berbasis PDGFα ing tikus nyebabake kelainan kraniofasial, kalebu cleft palate lan cacat tabung saraf12.Nanging, hubungan antarane jalur PI3K-AKT lan stabilitas AJ marang stratifikasi CNCC ora jelas.
Kita sadurunge ngenali SPECC1L minangka gen mutan pisanan ing rong wong kanthi sumbing abot sing ngluwihi saka tutuk menyang mripat, dikenal minangka sumbing miring (ObFC) utawa sumbing Tessier IV18.Mutasi SPECC1L wis diidentifikasi ing rong kulawarga multigenerasi kanthi sindrom Opitz G / BBB sing dominan autosomal (OMIM #145410), ing ngendi individu sing kena pengaruh nuduhake hyperdistance lan cleft lip / palate19, lan ing siji kulawarga kanthi sindrom overdistance Tibi (OMIM #145420)20 .luwih saka setengah kasus Opitz G / sindrom BBB X-disambung (OMIM # 300000) lan disebabake mutasi ing gen MID1, kang encode protein 22 saka balung sel microtubule-gandhengan.Kita hipotesis manawa SPECC1L, uga protein sing ana gandhengane karo mikrotubulus lan sitoskeleton aktin, bisa dadi mediasi sinyal sing dibutuhake kanggo remodeling sitoskeleton aktin sajrone adhesi sel lan migrasi 18.Liwat studi in vitro lan in vivo, saiki kita nggambarake SPECC1L minangka regulator anyar stabilitas AJ liwat sinyal PI3K-AKT.Ing tingkat seluler, kekurangan SPECC1L nyebabake nyuda tingkat protein pan-AKT lan nambah dispersi apikal-basal AJ, sing diilangi kanthi aktivasi kimia saka jalur AKT.Ing vivo, embrio sing kurang Specc11 nuduhake cacat penutupan tabung saraf lan nyuda dissection CNCC.Mangkono, fungsi SPECC1L ing sinyal adhedhasar adhesion sel sing diatur banget dibutuhake kanggo fungsi CNCC normal sajrone morfogenesis rai.
Kanggo nemtokake peran SPECC1L ing tingkat seluler, kita nggunakake garis sel osteosarcoma stabil sing diterangake sadurunge U2OS kurang ing SPECC1L18.Sèl U2OS sing stabil iki kanthi knockdown SPECC1L (kd) ngalami penurunan moderat (60-70%) ing tingkat transkrip lan protein SPECC1L, bebarengan karo cacat ing migrasi lan reorganisasi sitoskeleton aktin 18. SPECC1L wis dituduhake nyebabake cacat mitosis 23 .Sawise karakterisasi luwih lanjut, kita nemokake manawa sel SPECC1L-kd stabil kita ngganti morfologi kanthi tingkat patemon sing dhuwur banget (Gambar 1).Sel kontrol individu lan sel kd ing confluence kurang katon padha (Gambar 1A, D).24 jam sawise fusi, sel kontrol nahan wangun kuboid (Gambar 1B, E), nalika sel SPECC1L-kd elongated (Gambar 1C, F).Ombone owah-owahan ing wangun sel iki dijupuk dening in vivo pencitraan urip sel kontrol lan sel kd (film 1).Kanggo nemtokake peran SPECC1L ing sel konfluen, kita nliti ekspresine.Kita nemokake manawa tingkat protein SPECC1L mundhak nalika fusi (Gambar 1G), dene tingkat transkrip SPECC1L ora mundhak (Gambar 1H).Kajaba iku, nalika kapadhetan sel mundhak, protein SPECC1L akumulasi ing wates antarsel (Gambar 2A-E), kanthi pola tumpang tindih karo β-catenin sing ana gandhengane karo membran (Gambar 2A'-E').Given asosiasi SPECC1L karo sitoskeleton aktin 18,23 kita hipotesis yen SPECC1L sesambungan karo persimpangan adesif adhedhasar aktin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) sel elongate ing dhuwur confluence (F) dibandhingake kontrol sel U2OS (AC).Dituduhake ing kene ana telu saka enem titik wektu (T1, T3, T6) sing dipilih kanggo kapadhetan sel sing beda.(G) Analisis Western blot nuduhake yen protein SPECC1L stabil ing tingkat dhuwur saka patemon dibandhingake karo tingkat kurang saka patemon ing sel kontrol.Western blot saka SPECC1L nuduhake samesthine band 120 kDa lan band bobot molekul luwih, bisa post-translationally dipunéwahi (*).analisis Western blot dileksanakake ing kondisi padha kanggo kurang lan dhuwur confluence.Gambar sing nuduhake SPECC1L ing confluence kurang lan dhuwur dijupuk saka blot padha.Blot sing padha dibusak lan diteliti maneh karo antibodi β-aktin.(H) Analisis RT-PCR kuantitatif ora nuduhake owah-owahan sing signifikan ing tingkat transkrip SPECC1L.Bar kesalahan makili SEM saka papat eksperimen independen.
(AE) Kita milih enem titik wektu (T1-T6) sing makili sawetara kepadatan sel kanggo normalake analisis wangun sel lan owah-owahan AJ ing sel U2OS kanthi knockdown SPECC1L (kd).Lima titik wektu kasebut kalebu sel tunggal (T1), 50-70% fusi kluster sel cilik (T2), fusi tanpa mbentuk sel kd (T3), mbentuk sel kd (T4), lan owah-owahan 24 jam.ing wangun posterior sel kd (T5).Protein SPECC1L umume disebarake ing sitoplasma ing T1 (A), nanging akumulasi kasebut diamati ing wates antarsel ing titik wektu sabanjure (B-E, panah).(FJ) β-catenin nuduhake akumulasi sing padha ing wates antarsel sing ana gandhengane karo kompleks AJ.(A'-E') SPECC1L lan β-catenin nuduhake pewarnaan tumpang tindih ing wates sel kanthi kapadhetan sel dhuwur (panah).(F'-J') Ing sel SPECC1L-kd, pewarnaan β-catenin katon normal kanthi kapadhetan sel sing sithik (F'-H'), nanging ngembang nalika owah-owahan wujud sel (I', J'; panah), nuduhake yen AJ wis owah.Bar = 10 µm.
Kita banjur nyoba nemtokake efek saka kekurangan SPECC1L ing AJ.Kita nggunakake sawetara panandha sing ana gandhengane karo AJ, kalebu komponen kanonik F-aktin, myosin IIb, β-catenin, lan E-cadherin24,25,26,27.Serat stres aktin tambah ing sel SPECC1L-kd kaya sing diterangake sadurunge (Gambar 3A, B) 18.Myosin IIb sing digandhengake karo filamen aktin nuduhake peningkatan sing padha ing sel SPECC1L-kd ing vitro (Gambar 3C, D).β-catenin sing gegandhengan karo AJ ngiket cadherin ing membran sel, nuduhake pola ekspresi "honeycomb" normal ing kubosit kontrol (Gambar 3E, G).Apike, ing gambar datar nggunakake mikroskop confocal, β-catenin (Fig. 3E, F) lan E-cadherin (Fig. 3G, H) pewarnaan ing membran sel saka sel kurang SPECC1L konfluen nuduhake pola penting saka pewarnaan lengkap.Ekspansi pewarnaan β-catenin sing gegandhengan karo AJ ing sel kd iki paling jelas nalika pertemuan, nanging katon sadurunge owah-owahan ing wangun sel (Gambar 2F-J, F'-J').Kanggo nemtokake sifat fisik saka pewarnaan AJ sing ditambahi iki, kita mriksa wates sel ing permukaan apikal-basal sel SPECC1L-kd U2OS kanthi mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gambar 3I, J).Ing kontras kanggo sel kontrol (Fig. 3I), kang wis wilayah kandhel elektron kapisah nuduhake AJ (panah), sel kd (Fig. 3J) nuduhake gedhe, wilayah contiguous Kapadhetan elektron dhuwur indikatif AJ sadawane bidang apicobasal..Kajaba iku, ing bagean transversal, kita diamati lipatan membran sel ekstensif ing sel kd (Fig. S1A, B), sing nerangake pola lengkap pita pewarnaan β-catenin lan E-cadherin (Gambar 3F, H).Kanggo ndhukung peran SPECC1L ing AJs, β-catenin co-immunoprecipitated karo SPECC1L ing lisat sel U2OS konfluen (Gambar 3K).Bebarengan karo immunostaining lengkap kanggo panandha AJ, analisis TEM konsisten karo hipotesis yen kekurangan SPECC1L nambah Kapadhetan lan varians apikal-basal AJ.
(AH) Tambah pewarnaan F-aktin ing sel kd ing 48 jam sawise fusi (T6; A, B).Pewarnaan myosin IIb sing diowahi sing digandhengake karo F-aktin (C, D).Pola lancar pewarnaan membran β-catenin lan E-cadherin ing sel kontrol (E, G) ditingkatake ing sel SPECC1L-kd (F, H).Bar = 10 µm.(I-J) Mikrograf elektron ngamati persimpangan antarsel apikal-basal.Sèl kontrol nuduhake wilayah sing kandhel elektron sing béda sing nuduhaké persimpangan lengket (I, panah).Ing kontras, kabeh persimpangan apikal-basal ing sel SPECC1L-kd katon elektron padhet (J, panah), nuduhake tambah Kapadhetan lan dispersi persimpangan adhesive.(K) β-catenin digabungake karo SPECC1L ing lisat sel U2OS konfluen.Gambar dijupuk saka siji titik sing makili salah siji saka papat eksperimen independen.
Kanggo mangerteni peran SPECC1L ing morfogenesis craniofacial, kita nggawe model mouse sing kurang Specc1l nggunakake rong garis sel jebakan ES independen, DTM096 lan RRH048 (BayGenomics, CA), sing makili transkrip intron 1 lan Specc1l dijupuk ing 15 (Fig. 1) .4A, gambar S2).Lokasi genom saka sisipan vektor decoy ditemtokake dening urutan genom kabeh lan dikonfirmasi dening PCR (Fig. S2).Loro-lorone desain jebakan gen uga ngidini fusi ing pigura saka wartawan Specc11-lacZ nalika dijupuk.Mulane, ekspresi lacZ sing ditemtokake dening pewarnaan X-gal digunakake minangka indikator ekspresi Specc11.Kaloro alel kasebut nuduhake pola ekspresi lacZ sing padha, kanthi jebakan gen DTM096 ing intron 1 nuduhake ekspresi sing luwih kuat tinimbang RRH048 ing intron 15 (ora ditampilake).Nanging, Specc1l diungkapake sacara wiyar, kanthi ekspresi sing kuat banget ing lipatan saraf ing E8.5 (Gambar 4B), ing tabung saraf lan proses rai ing E9.5 lan E10.5 (Gambar 4C, D), lan ngembangake anggota awak. ing E10.5 lan mripat (Gambar 4D).Kita sadurunge nglapurake yen ekspresi SPECC1L ing lengkungan pharyngeal pisanan ing E10.5 ana ing epitelium lan mesenchyme18 sing ndasari, konsisten karo garis keturunan CNCC.Kanggo nguji ekspresi SPECC1L ing CNCC, kita nindakake lipatan saraf E8.5 (Gambar 4E-J) lan bagean tengkorak E9.5 (Gambar 4K-).Ing E8.5, SPECC1L diwarnai lipatan saraf kanthi intens (Gambar 4E, H), kalebu sel sing diwarnai karo penanda NCC (Gambar 4G, J).Ing E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) banget diwarnai migrasi CNCC co-stained karo AP2A (Fig. 4L, M) utawa SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Representasi skematik saka gen Specc11 mouse sing nuduhake penyisipan vektor umpan ing klon sel ES DTM096 (intron 1) lan RRH048 (intron 15).(BD) pewarnaan lacZ saka embrio Specc1lDTM096 heterozigot sing makili ekspresi Specc1l saka E8.5 nganti E10.5.NE = neuroectoderm, NF = lipatan saraf, PA1 = arkus pharyngeal pertama.(EP) SPECC1L immunostaining kanthi penanda NCC AP2A lan SOX10 ing lipatan saraf E8.5 (NF; EJ) lan bagean tengkorak E9.5 (KP).Pewarnaan SPECC1L diamati kanthi akeh ing lipatan saraf E8.5 (E, H; panah), kalebu sel sing dilabel AP2A (F, G; panah) lan SOX10 (I, J; panah).Ing E9.5, SPECC1L banget diwarnai migrasi CNCCs (K, N; panah) kanthi label AP2A (L, M; panah) lan SOX10 (O, P; panah).
Nyebrang antarane tikus Specc1lDTM096/+ lan Specc1lRRH048/+ heterozigot nuduhake yen loro alel jebakan gen ora saling melengkapi lan senyawa heterozigot lan homozigot embrio kanggo salah siji alel jebakan gen iku embrio matine (Tabel S1).Rasio Mendelian nuduhake penurunan tingkat kelangsungan hidup heterozigot nalika lair (karepake 1.34 vs. 2.0).Kita nyathet mortalitas perinatal sing kurang ing antarane heterozigot, sawetara duwe anomali craniofacial (Gambar S3).Nanging, penetrasi kurang saka fenotipe kraniofasial perinatal iki ndadekake angel nyinaoni mekanisme patofisiologis sing ndasari.Mulane, kita fokus ing fenotipe mateni embrio saka mutan Specc11 homozygous.
Umume embrio mutan Specc1lDTM096 / RRH048 senyawa heterozigot utawa homozigot ora berkembang sawise E9.5-10.5 (Gambar 5A-D), lan tabung saraf ora nutup anterior (Gambar 5B, D) lan kadhangkala ditutup ing mburi (ora ditampilake) ..Cacat penutupan tabung saraf kranial iki digandhengake karo mayoritas CNCC sing ditandhani DLX2 sing isih ana ing lipatan saraf ing E10.5, sing nuduhake ora ana dissection (Gambar 5A'-D').Kanggo nemtokake manawa ukuran sakabèhé CNCC uga suda, kita menehi tag garis CNCC karo GFP ing garis jebakan gen karo Wnt1-Cre lan ROSAmTmG.We stream diurutake GFP + NCC lan GFP- (RFP +) non-NCC saka kabèh embrio.Ing E9.5, proporsi aliran-diurutake GFP-label CNCCs ora owah-owahan Ngartekno antarane WT lan embrio mutant (ora ditampilake), nuduhake specification CNCC normal.Mulane, kita hipotesis yen sisa pewarnaan Wnt1-Cre lan DLX2 ing lipatan saraf sing katon (Gambar 5B ') amarga lapisan CNCC sing rusak, bisa uga amarga tambah Kapadhetan utawa penyebaran sel AJ, kaya sing katon ing sel SPECC1L-kd.Kita nggunakake penanda NCC SOX10, AP2A, lan DLX2 kanggo konfirmasi anané CNCC ing lipatan saraf (Gambar 5E-R).Ing E8.5, pewarnaan lipatan saraf kanggo kabeh telung marker NCC diamati ing bagean WT (Gambar 5E, G, I) lan mutan Specc1l (Gambar 5F, H, J).Ing E9.5, nalika tandha NCC diwarnai migrasi NCC ing bagean WT (Gambar 5M, O, Q), sisa pewarnaan NCC diamati ing lipatan saraf sing kapapar saka embrio mutan Specc1l (Gambar 5N, P, R).Amarga SOX10 lan DLX2 nandhani migrasi CNCC, asil iki nuduhake manawa CNCC sing kekurangan SPECC1L entuk spesifikasi pasca migrasi nanging gagal migrasi saka lipatan saraf.
Kekurangan Specc11 nyebabake penutupan tabung saraf sing rusak, delaminasi sel crest saraf kranial lan AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrio sing nggawa sel crest neural cranial migrasi (CNCC) kanthi label Wnt1-Cre (A').Beda, embrio mutan Specc11 nuduhake lipatan saraf sing mbukak (B), panah) lan CNCC sing durung migrasi (B', panah).(C, D') Gambar lapangan sing padhang (C, D') lan immunostaining (C', D') saka penanda CNCC DLX2 saka embrio E10.5 WT (C, C') lan Specc1l (D, D').Ing WT E10.5 embrio, DLX2-positif CNCC ngjajah lengkungan insang (C', panah), nalika ing mutan, pewarnaan sing katon tetep ana ing lipatan saraf sing mbukak (D', panah) lan ing lengkungan pharyngeal pisanan (D', panah).) karo sawetara pewarnaan (panah) nuduhake delamination miskin lan migrasi saka CNCC.ER) Bagean embrio mutan WT lan Specc1l ing tahap E8.5 (E–L) lan E9.5 (M–R) dilabeli nganggo penanda NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) lan DLX2 (I, J, Q, R).Ing E8.5, pewarnaan NCC diamati ing lipatan saraf tipe liar (NF) lan bagean mutan.Co-staining SOX10 lan β-catenin ing E8.5 WT (K) lan mutan (L) ngungkapake pewarnaan β-catenin sing tambah ing wates sel ing lipatan saraf.Ing E9.5, pewarnaan jinis liar saka CNCCs sing migrasi (M, O, Q) diamati, nalika ing mutan, CNCC sing ora dilapisi diwarnai lipatan saraf sing mbukak (N, P, R).(S–Z) Analisis labeling in vivo AJ ing bagean koronal embrio WT lan Specc11DTM096/RRH048 kanthi mutasi E9.5.Bidang bagean kira-kira ditampilake ing pojok tengen ndhuwur.Ing bagean saka jaringan mutan, tambah pewarnaan F-actin (S, T) lan myosin IIb (U, V) diamati.Kaya asil in vitro ing Gambar 3, ing embrio mutan, pewarnaan membran sing ditingkatake kanggo β-catenin (W, X) lan E-cadherin (Y, Z) diamati.(AA-BB) Mikrograf elektron saka bagean embrio jinis liar sing katon ngluwihi wates sel apikal-basal nuduhake wilayah sing padhet elektron sing nuduhake sambungan adesif (AA, panah).Ing kontras, ing bagean saka Specc11 embrio mutant (BB, panah), kabeh persimpangan apicobasal kandhel elektron, nuduhake tambah Kapadhetan lan dispersi persimpangan adesif.
Kanggo nguji hipotesis kita yen lapisan suda amarga AJ sing diowahi, kita mriksa label AJ ing lipatan saraf sing kapapar embrio mutan Specc1l (Fig. 5S-Z).We diamati Tambah ing serat kaku aktin (Fig. 5S, T) lan concomitant tambah lokalisasi myosin IIB pewarnaan ing serat aktin (Fig. 5U, V).Penting, kita diamati tambah pewarnaan β-catenin (Gambar 5W, X) lan E-cadherin (Gambar 5Y, Z) ing wates intercellular.Kita uga nliti pewarnaan β-catenin saka NCC ing lipatan saraf saka embrio E8.5 (Gambar 5K, L).Pewarnaan β-catenin katon luwih kuat ing lipatan saraf mutan Specc1l (Gambar 5L lan K), nuduhake yen owah-owahan AJ wis diwiwiti.Ing micrographs elektron bagean tengkorak saka E9.5 embrio, kita maneh diamati tambah kasebar electron-padhet pewarnaan ing Specc1l embrio mutant dibandhingake WT (Fig. 5AA, BB lan S1E-H).Digabungake, asil iki ndhukung asil in vitro ing sel SPECC1L-kd U2OS lan nuduhake yen pewarnaan AJ sing aberrant sadurunge stratifikasi CNCC ing embrio mutan kita.
Amarga ana hubungan antagonis sing dikenal ing antarane aktivitas AKT lan stabilitas E-cadherin, 17,28 kita hipotesis keterlibatan sinyal PI3K-AKT.Kajaba iku, kita mirsani blistering subepidermal ing sawetara embrio mutant kita sing oncat lethality (<5%) ing E9.5-10.5 lan tinimbang dumunung ing watara E13.5 (Fig. S3).Vesikel subepidermal minangka ciri khas sinyal PI3K-AKT sing dikurangi adhedhasar PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) nglaporake yen gangguan aktivasi PI3K berbasis PDGFRα ing embrio mutan PdgfraPI3K / PI3K nyebabake vesikel subepidermal, cacat tabung saraf, lan fenotipe langit-langit sumbing.Pancen, tingkat pan-AKT lan aktif fosforilasi Ser473-AKT dikurangi ing vivo ing jaringan mutan Specc1l dadi penahanan embrio E9.5 (Gambar 6A-D).Ngurangi tingkat fosforilasi Ser473-AKT bisa uga amarga nyuda tingkat pan-AKT ing vivo (Gambar 6E) lan in vitro (Gambar 6F).Penurunan in vitro diamati mung nalika sel U2OS padha banget konfluen karo owah-owahan ing wangun sel lan Kapadhetan AJ (Gambar 6D).Mangkono, data kita nuduhake manawa SPECC1L minangka regulator positif saka sinyal PI3K-AKT ing morfogenesis craniofacial.
(A-E) E8.5 (A,B) lan E9.5 (C,D) bagean tengkorak utawa lisat E9.5 saka embrio mutan Specc1l (E) sing nuduhake tingkat fosforilasi aktif S473-AKT lan reduksi Protein pan-AKT , dibandhingake kontrol WT.Western blotting iki dileksanakake ing lysates alam bébas lan lysates mutant ing kondisi padha.Gambar sing ditampilake kanggo SPECC1L dijupuk saka siji blot.Blot sing padha dibusak lan diteliti maneh karo antibodi anti-pan-ACT lan β-actin.Tingkat Pan-AKT ing lipatan saraf E8.5 (A, B) lan tingkat fosforilasi S473-AKT ing bagean tengkorak E9.5 dikurangi sacara signifikan.(F) Tingkat Pan-AKT padha suda ing lisat sel SPECC1L-kd U2OS sing dipanen ing patemon dhuwur.Bar kesalahan makili SEM saka telung kuantitas blot Western independen.(GJ) Bagean embrio WT ing E9.5 diwarnai karo KI67 lan caspase 3 sing dibelah, nuduhake proliferasi sel (G, G ') lan aktivitas apoptosis cilik (H, H ').Embrio mutan Specc11 nuduhake proliferasi sel sing padha (I), nanging jumlah sel sing ngalami apoptosis saya tambah akeh (J).
Kita banjur mriksa tandha proliferasi lan apoptosis.Kita ora weruh prabédan ing proliferasi embrio E9.5 (Gambar 6E, G dibandhingake karo I) kanthi indeks proliferasi 82.5% kanggo mutan WT lan 86.5% kanggo mutan Specc1l sing diukur kanthi pewarnaan KI67 (p <0.56, Fisher's). tes akurat).Kajaba iku, kita ora mirsani prabédan ing apoptosis sing diukur kanthi pewarnaan kanggo caspase 3 ing lipatan saraf ing E8.5 nganti penahanan embrio (ora ditampilake) (ora ditampilake).Ing kontras, apoptosis tambah akeh ing kabeh embrio mutan E9.5 (Gambar 6F, H lan J).Tambah sakabèhé ing apoptosis iki konsisten karo nyuda PI3K-AKT signaling lan lethality embrio awal29,30,31.
Sabanjure, kanggo ngonfirmasi peran sebab-akibat kanggo sinyal PI3K-AKT ing owah-owahan AJ ing sel kd kita, kita kanthi kimia ngowahi jalur kontrol lan sel kd (Gambar 7A-F).Kita digunakake minangka panandha phenotype owah-owahan wangun sel diamati ing sel SPECC1L-kd confluent, kang kita diukur nggunakake rasio dimensi paling dawa (dawa) kanggo dimensi vertikal cocog (jembaré).Rasio 1 samesthine kanggo sel sing relatif bunder utawa kuboid (Gambar 7G).Saliyane wangun sel, kita uga ngonfirmasi efek ing AJ kanthi pewarnaan β-catenin (Gambar 7A'-F').Inhibisi jalur PI3K-AKT nggunakake wortmannin cukup kanggo ngganti wujud sel ing sel kontrol (Gambar 7A, C) lan AJ (Gambar 7A ').PI3K-AKT aktivator SC-79 ora mengaruhi wangun sel (FIG. 7A, E) utawa expansion AJ (FIG. 7A ') ing sel kontrol.Ing sel SPECC1L-kd, penindasan luwih saka jalur PI3K-AKT nyebabake apoptosis tambah (Gambar 7B, D) lan paningkatan pewarnaan β-catenin (Gambar 7B '), konsisten karo mutan abot ing vivo kita.Sing penting, aktivasi jalur PI3K-AKT kanthi signifikan ningkatake bentuk sel (Gambar 7B, F) lan fenotipe AJ (Gambar 7B ").Owah-owahan ing wangun sel diukur minangka rasio roundness sèl (CCR) lan dibandhingake pinunjul minangka diterangake ing ndhuwur (Gambar 7G).Pancen, ing sel kontrol (Gambar 7G, CCR = 1.56), perawatan wortmannin cukup kanggo ngowahi bentuk sel kanthi signifikan (Gambar 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) nganti meh padha karo sing diamati. ing SPECC1L.-kd sel (Fig. 7G, CCR = 3.46).Perawatan Wortmannin saka sel SPECC1L-kd (Gambar 7G, CCR = 3.60, diabaikan) ora luwih penting tinimbang sel kd sing ora diobati (Gambar 7G, CCR = 3.46, diabaikan) utawa sel kontrol sing diobati wortmannin (Gambar 7G)., CCR = 3,46, diabaikan) tambahan mengaruhi elongation sel (7G, CCR = 3,61, diabaikan).Sing paling penting, aktivator SC-79 AKT mulihake fenotipe elongated sel SPECC1L-kd (Gambar 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Asil kasebut ngonfirmasi yen SPECC1L ngatur sinyal PI3K-AKT lan nuduhake yen penurunan moderat ing SPECC1L mengaruhi adhesi sel, dene penurunan sing kuat nyebabake apoptosis (Gambar 8).
(A–F') Kontrol (A, C, E) lan SPECC1L-kd (B, D, F) sel diobati karo PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) utawa SC-79 aktivator (E, F) Perawatan .Sel kontrol sing ora diobati yaiku kuboid (A) kanthi pewarnaan seluler kucing β normal (A'), dene sel kd dipanjangake (B) kanthi pewarnaan β-cat (B').Sawise dipateni jalur PI3K-AKT, sel kontrol elongated (C) kanthi ekspansi β-cat (C'), dene sel kd wiwit ngalami apoptosis (D), padha karo embrio sing mutasi banget lan nuduhake β-kucing sing ditingkatake.pewarnaan (D').Sawise aktivasi jalur PI3K-AKT, sel kontrol tetep kuboid (E) lan nduweni pewarnaan β-cat (E'), nalika sel kd nuduhake pewarnaan wangun sel (F) lan β-cat (F') sing luwih apik, nuduhake. (G) Derajat saka owah-owahan wangun sel ing (AF) diukur nggunakake rasio roundness sel (CCR) saka dimensi paling dawa (dawa) lan dimensi vertikal cocog (jembaré) nggunakake piranti lunak MetaMorph.Sel SPECC1L-kd sing ora diobati (NT) (CCR = 3.46) luwih dawa tinimbang sel kontrol (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Inhibisi Wort saka jalur PI3K-AKT ing sel kontrol cukup kanggo nyebabake elongasi sing padha ing wangun sel (CCR = 3.61, p<2.4 × 10-9).Kajaba iku, aktivasi AKT dening SC-79 ing sel SPECC1L-kd mulihake elongasi sel kanggo ngontrol tingkat (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Pangobatan Wortmannin saka sel SPECC1L-kd ngasilake apoptosis sing tambah nanging ora ana owah-owahan wujud sel (CCR = 3.60) dibandhingake karo kd sing ora diobati (CCR = 3.46, ns) utawa sel kontrol sing diobati wortmannin (3.61) sing diamati ing .ns = ora ketompo.+/- pangukuran SEM kanggo 50 sel ditampilake.Bedane statistik diitung nggunakake tes t Student.
(A) Perwakilan skematik saka inhibisi lan aktivasi jalur PI3K-AKT sing nyebabake owah-owahan lan nylametake AJ.(B) Model sing diusulake kanggo stabilisasi protein AKT dening SPECC1L.
CNCCs premigratory mbutuhake lisis AJ kanggo misahake saka sel neuroepithelial lipatan saraf anterior1,15,32.Nambah pewarnaan komponen AJ lan mundhut distribusi asimetris apikal-basal AJ ing sel kekurangan SPECC1L loro in vitro lan in vivo, digabungake karo jarak fisik SPECC1L kanggo β-catenin, nuduhake yen SPECC1L nduweni fungsi kanggo njaga stabilitas lokal AJ kanthi bener. otot organisasi.sitoskeleton aktin.Asosiasi SPECC1L karo sitoskeleton aktin lan β-catenin lan paningkatan jumlah filamen aktin sing dikondensasi tanpa ana SPECC1L konsisten karo paningkatan sing diamati ing kerapatan AJ.Kemungkinan liyane yaiku tambah akeh serat aktin ing sel sing kurang SPECC1L ndadékaké owah-owahan ing ketegangan antarsel.Amarga stres seluler mengaruhi dinamika AJ 33, owah-owahan voltase bisa nyebabake AJ 34 luwih nyebar.Dadi, owah-owahan bakal mengaruhi lapisan CNCC.
Wnt1 dituduhake ing lipatan saraf awal sing nyebabake sel puncak saraf.Mangkono, tracing garis keturunan Wnt1-cre nandhani NCC35 sadurunge lan migrasi.Nanging, Wnt1 uga menehi tandha klon jaringan otak dorsal uga asalé saka lipatan saraf awal 35,36, saéngga pewarnaan mutan E9.5 kita kanggo penanda Wnt1 ing lipatan saraf mbukak ora CNCC.Pewarnaan positif kanggo penanda NCC AP2A lan SOX10 dikonfirmasi manawa lipatan saraf sing kapapar saka embrio mutan Specc11 pancen ngemot CNCC.Kajaba iku, amarga AP2A lan SOX10 minangka tandha saka NCC migrasi awal, pewarnaan positif nuduhake yen sel kasebut minangka CNCC pasca migrasi sing ora bisa dilapisi dening E9.5.
Data kita nuduhake manawa regulasi molekuler AJ dening SPECC1L ditengahi dening sinyal PI3K-AKT.Sinyal AKT dikurangi ing sel lan jaringan sing kurang SPECC1L.Temuan dening Fantauzzo et al.ndhukung peran langsung kanggo sinyal PI3K-AKT ing morfogenesis craniofacial.(2014) nuduhake yen kekurangan aktivasi sinyal PI3K-AKT berbasis PDGFRα ndadékaké phenotype palate cleft.Kita uga nuduhake yen inhibisi jalur PI3K-AKT cukup kanggo ngganti AJ lan wangun sel ing sel U2OS.Konsisten karo temuan kita, Kain et al.37 nuduhake yen downregulation saka subunit PI3K α110 ing sel endothelial nyebabake peningkatan sing padha ing pewarnaan β-catenin periselular, sing diarani minangka peningkatan "indeks konektivitas".Nanging, ing sel endothelial sing filamen aktin wis diatur banget, penindasan jalur PI3K-AKT nyebabake wangun sel sing longgar.Ing kontras, SPECC1L-kd U2OS sel nuduhake wangun sel elongated.Bedane iki bisa uga spesifik jinis sel.Nalika dipatèni sinyal PI3K-AKT permanen mengaruhi sitoskeleton aktin, efek ing wangun sel ditemtokake dening owah-owahan ing tension disebabake owah-owahan ing Kapadhetan lan organisasi saka serat aktin tengah.Ing sel U2OS, kita mung nggunakake owah-owahan wangun sel minangka tandha owah-owahan lan pemulihan AJ sing kurang SPECC1L.Ing kesimpulan, kita hipotesis yen inhibisi jalur AKT ing kekurangan SPECC1L nambah stabilitas AJ lan nyuda delaminasi ing CNCC.
Apike, tingkat pan-AKT dikurangi in vitro lan in vivo saliyane tingkat fosforilasi 473-AKT tanpa ana SPECC1L, nyaranake regulasi sinyal PI3K-AKT ing tingkat stabilitas utawa turnover protein AKT.Gen SPECC1L lan MID1, sing digandhengake karo sindrom Opitz/GBBB, ngode protein sing nyetabilake mikrotubulus 18,22.Mekanisme sing SPECC1L lan MID1 mediasi stabilisasi microtubule ora dimangerteni kanthi lengkap.Ing kasus SPECC1L, stabilisasi iki kalebu asetilasi sing ditingkatake saka subset mikrotubulus 18.Bisa uga SPECC1L nggunakake mekanisme sing padha kanggo nyetabilake protein liyane kayata AKT.Wis ditampilake yen asetilasi residu lisin ing protein AKT nyebabake nyuda lokalisasi membran lan fosforilasi38.Kajaba iku, ubiquitination rantai K63 ing residu lisin sing padha ing AKT dibutuhake kanggo lokalisasi lan aktivasi membran39,40.Antarane sawetara faktor sing sesambungan karo protein SPECC1L sing diidentifikasi ing macem-macem layar ragi loro-hibrida dhuwur, papat - CCDC841, ECM2942, APC lan UBE2I43 - wis kena pengaruh ing turnover utawa stabilitas protein liwat ubiquitination utawa sumoylation.SPECC1L bisa uga melu modifikasi pasca translasi residu lisin AKT, sing mengaruhi stabilitas AKT.Nanging, peran kritis SPECC1L ing lokalisasi lan stabilitas protein AKT isih kudu dijlentrehake.
Cacat parah ing ekspresi SPECC1L ing vivo nyebabake pewarnaan marker AJ lan overlay CNCC sing cacat, uga nambah apoptosis lan kematian embrio awal.Laporan sadurunge nuduhake yen mutan tikus kanthi tingkat apoptosis sing luwih dhuwur digandhengake karo cacat tabung saraf 44,45,46,47 lan cacat kraniofasial48.Wis disaranake yen pati sel sing berlebihan ing lipatan saraf utawa lengkungan pharyngeal bisa nyebabake jumlah sel sing ora cukup sing dibutuhake kanggo gerakan morfogenetik sing tepat 48,49,50.Ing kontras, garis sel kekurangan SPECC1L kita kanthi ekspresi SPECC1L sing rada suda mung nuduhake owah-owahan AJ tanpa bukti tambah pati sel.Nanging, inhibisi kimia saka jalur PI3K-AKT ing sel Kd kasebut nyebabake apoptosis tambah.Mangkono, nyuda moderat ing ekspresi utawa fungsi SPECC1L njamin kaslametané sel.Iki konsisten karo pengamatan sing langka Specc11 embrio mutant sing uwal penahanan ing St.E9.5-mbok menawa amarga ngurangi efisiensi panangkepan gen-bisa nutup tabung saraf lan mandheg ing perkembangane, asring kanthi cacat kraniofasial (Gbr. S3).Uga konsisten karo iki yaiku kedadeyan langka saka embrio Specc1l heterozygous kanthi kelainan kraniofasial-mbokmenawa amarga tambah efisiensi panangkepan gen-uga temuan ing iwak zebra ing ngendi salah siji saka rong orthologues SPECC1L (specc1lb) nyebabake fenotipe embrio pungkasan, kalebu mundhut rahang ngisor lan celah bilateral51.Mangkono, mutasi mundhut fungsi SPECC1L heterozigot sing diidentifikasi ing pasien manungsa bisa nyebabake gangguan cilik ing fungsi SPECC1L sajrone morfogenesis craniofacial, cukup kanggo nerangake celah orofacial.Regulasi kontak intercellular adhedhasar SPECC1L bisa uga nduweni peran ing palatogenesis lan fusi lengkung pharyngeal.Panaliten luwih lanjut babagan fungsi SPECC1L bakal mbantu njlentrehake peran kontak intercellular sementara ing CNCC sajrone penutupan tabung saraf ing motilitas sel neuroepithelial lan morfogenesis kraniofasial.
Kontrol osteosarcoma U2OS lan sel SPECC1L-kd wis diterangake sadurunge (Saadi et al., 2011).Antibodi marang SPECC1L uga wis ditondoi sadurunge (Saadi et al., 2011).Antibodi anti-β-catenin (terwelu; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mouse; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Teknologi Sinyal Sel, Danvers, MA), caspase 3 (1: 1000; Teknologi Sinyal Sel, Danvers, MA) lan β-actin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) digunakake minangka diterangake..Filamen aktin diwarnai karo Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Sel kontrol U2OS lan sel SPECC1L-kd dibudidaya ing DMEM glukosa dhuwur standar sing ditambah karo 10% serum sapi janin (Life Technologies, Carlsbad, CA).Kanggo owah-owahan AJ, 2 x 105 sel diwutahake ing kaca sing diobati karo gelatin babi 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lan diamati kanggo owah-owahan ing wangun sel.Sel diklumpukake ing titik wektu sing beda-beda: 4 jam sawise seeding (t = 1), 24 jam sawise seeding (t = 2), confluence tanpa owah-owahan ing wangun sel (t = 3), owah-owahan ing wangun sel (t = 4) , 24 jam sawise owah-owahan wangun sel (t = 5) lan 48 jam sawise owah-owahan wangun sel (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Kanggo modulasi jalur PI3K-AKT, sel dikultur ing konsentrasi sing dituduhake karo wortmannin inhibitor PI3K-AKT (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) utawa aktivator SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Media sing ngemot bahan kimia diganti saben dina.
Rekaman frame-by-frame digawe ing kontrol langsung lan sel KD ing kondisi kultur normal, lan gambar kontras fase diklumpukake saben 10 menit suwene 7 dina.Gambar dipikolehi nggunakake mikroskop terbalik Leica DM IRB sing dikontrol komputer sing dilengkapi panggung mekanik lan objektif 10 × N-PLAN sing disambungake menyang kamera QImaging Retiga-SRV.Sajrone pencitraan, kultur sel dijaga ing 37 ° C ing atmosfer lembab kanthi 5% CO2.
Loro garis sel ES jebakan gen DTM096 lan RRH048 saka Pusat Sumber Daya Mouse Mutant Regional (UC Davis, CA) digunakake kanggo ngasilake garis tikus sing kurang Specc11, sing ditunjuk Specc1lgtDTM096 lan Specc1lgtRRH046.Sedhela, 129 / REJ ES sel disuntikake menyang blastokista C57BL6.Tikus lanang chimeric sing diasilake dikembangake karo tikus C57BL6 wadon kanggo ngenali turunane kanthi pewarnaan jas agouti.Anane sisipan vektor jebakan gen digunakake kanggo ngenali heterozigot.Tikus disimpen ing latar mburi campuran 129/REJ;C57BL6.Lokasi situs penyisipan vektor jebakan genetik dikonfirmasi dening RT-PCR, urutan genom, lan komplementasi genetik (Tambahan Gambar 1).Kanggo nglacak garis keturunan CNCC saka tikus Specc1lGT heterozigot dobel, tikus ROSAmTmG (#007576) lan Wnt1-Cre (#003829) (Laboratorium Jackson, Bar Harbor, ME) disilangkan kanggo ngasilake alel ROSAmTmG lan Wnt1-Cre ing mutant Specc1osl.Kabeh eksperimen ing tikus ditindakake miturut protokol sing disetujoni dening Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Kansas Medical Center.
Embrio tetep ing (1% formaldehida, 0,2% glutaraldehida, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) kanggo 60 menit ing suhu kamar.Sawise fiksasi ing larutan pewarnaan X-gal (5 mM kalium ferricyanide, 5 mM kalium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0,01% sodium deoxycholate, 0,02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Pengembangan pewarnaan ditindakake ing 37 ° C. .°C sajrone 1-6 jam.Embrio dipasang ing 4% PFA lan digambarake.
Kanggo Western blotting, sel lysed ing buffer lisis pasif (Promega, Fitchburg, WI) ditambah karo campuran HALT inhibitor protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates diproses ing 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX gel siap (Bio-Rad, Hercules, CA) lan ditransfer menyang membran Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrane diblokir ing susu 5% ing PBS sing ngemot 0,1% Tween.Antibodi diinkubasi sewengi ing 4 ° C utawa siji jam ing suhu kamar.Reagen Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) digunakake kanggo ngasilake sinyal.Kanggo immunostaining, embrio tetep sewengi ing 4% PFA / PBS lan cryopreserved.Cryosections jaringan diblokir ing PBS sing ngemot 1% serum wedhus normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) lan 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lan banjur diinkubasi ing 4 ° C ing inkubator sajrone wengi.kanthi anti-antibodi lan antibodi sekunder neon (1:1000) suwene 1 jam ing 4°C.Bagean sing diwarnai diselehake ing medium emas ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) lan gambar datar dijupuk nggunakake mikroskop confocal Leica TCS SPE.Saben immunostaining ditindakake minangka telung eksperimen independen ing cirossections paling ora rong embrio mutan.Eksperimen perwakilan ditampilake.
Sel diinkubasi ing buffer RIPA sing dimodifikasi (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserol, 2 mM EDTA, lan HALT inhibitor protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Sedhela, lysates padha prepurified karo protein G manik-manik magnetik (Life Technologies, Carlsbad, CA) lan banjur inkubasi sewengi ing 4 ° C. karo anti-SPECC1L utawa IgG protein manik-manik protein G digunakake kanggo extract SPECC1L lan Western blotting wis dileksanakake nggunakake anti-SPECC1L utawa IgG protein. Antibodi -β-catenin sing diterangake ing ndhuwur Eksperimen co-IP sing ditampilake minangka wakil saka papat eksperimen independen.
Sel kultur tetep utawa jaringan embrio tikus diwenehake menyang pusat mikroskop elektron ing Pusat Kesehatan Universitas Kansas.Sedhela, conto ditempelake ing resin EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerisasi sewengi ing 60 ° C, lan dipérang ing 80 nm nggunakake ultramicrotome Leica UC7 sing dilengkapi glathi berlian.Bagean digambarake nggunakake mikroskop elektron transmisi JEOL JEM-1400 sing dilengkapi bedhil Lab6 100 kV.
Carane nyebut artikel iki: Wilson, NR et al.Kekurangan SPECC1L nyebabake stabilitas sendi sing disambung lan nyuda delaminasi sel crest neural cranial.ngelmu.6, 17735;doi: 10.1038 / srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksi lan diferensiasi saka puncak saraf.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Sèl crest neural cranial ing gerakan: perané ing perkembangan craniofacial.American Journal of Medical Genetics.Bagean A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: wutah lan pangembangan luwih saka 20 taun.Dokter anak.patologi.laboratorium.obat.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU, Noten MM Terobosan ing genetika celah orofacial.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. lan Riley, FM Mekanisme molekuler saka migrasi sel crest neural cranial lan pola sajrone perkembangan craniofacial.Pangembangan 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH lan Murray, JK Bibir lan langit-langit sumbing: pangerten pengaruh genetik lan lingkungan.komentar natural.Genetika 12, 167-178, doi: 10.1038 / nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfogenesis abnormal saka kulit, perangan awak, lan wilayah craniofacial ing interferon-regulating factor-6 (Irf6) -kekurangan tikus.Generasi Nasional.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutasi dominan ing GRHL3 nyebabake sindrom van der Waord lan ngganggu perkembangan periderm lisan.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ lan Juriloff, DM Nganyari dhaptar mutan mouse kanthi cacat ing penutupan tabung saraf lan kemajuan menyang pemahaman genetis lengkap babagan penutupan tabung saraf.Penyelidikan cacat lair.Part A, Teratologi Klinis lan Molekuler 88, 653-669, doi: 10.1002 / bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling ngatur kaslametan lan proliferasi ing pangembangan balung liwat jalur intraseluler gumantung p53.Pangembangan gen 28, 1005-1017, doi: 10.1101 / gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND lan Murdoch, JN Disheveled: Hubungan ekspansi konvergen menyang penutupan tabung saraf.Tren ing neurologi.26, 453-455, doi: 10.1016 / S0166-2236 (03) 00212-1 (2003).